JJF(鲁) 138-2022 荧光定量PCR仪校准规范

JJF
山东省地方计量技术规范
JJF(鲁)138-2022
实时荧光定量PCR仪校准规范
Calibration Specification for Real-Time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer
2022一06一24发布2022一07—01实施
山东省市场监督管里局发布

1范围
本规范适用于实时荧光定量PCR仪的校准，其他类型PCR仪相同原理部分可参照本规范执行。
2引用文件
本规范引用了下列文件：
JJF1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范
YYT1173-2010聚合酶链反应分析仪
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范：凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。
3术语
YYT1173-2010中界定的及以下术语和定义适用于本规范。
3.1PCR(聚合酶链反应)polymerase chain reaction
PCR即聚合酶链反应是一种对特定的DNA或NA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性一迟火一延伸三个基本反应步骤构成。[YYT1173-2010,术语和定义3.1]
3.2PCR仪（聚合酶链反应分析仪）polymerase chain reaction analyzer,PCR analyzer基于PCR技术原理，模拟DNA或者RNA的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增己知序列，对其进行检测分析的仪器设备。[YYT1173-2010,术语和定义3.2]
3.3实时荧光定量PCR仪rea-time fluorescent quantitative PCR analyzer,RFQ-PCR analyzer
可以实现DNA或者RNA的扩增，根据PCR过程中荧光染料释放的荧光强度的变化对扩增产物量进行定量分析，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量进行分析的仪器设备。
3.4温度示值误差temperature indication error
温控装置（如均热块）的设定值与所有采样孔实际温度平均值之差。单位：摄氏度，符号：℃。

3.5
温度均匀度temperature uniformity
均热块所有采样测量孔温度在某一腸时任意两点温度之间的最大差值。单位：摄氏度，符号：℃。
3.6温度波动度temperature volatility
在被检设备稳定的状态下，在规定的时间间隔内，均热块所有采样点中任意一点温度随时间的变化量。单位：摄氏度，符号：C。
3.7温度最大过冲量temperature maximum overshoot
均热块温度升高或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出（高于或低于）设定值的最大幅度。单位：摄氏度，符号：℃。
3.8平均升温速率mean heating rate
升温过程中模块单位时间内上升的平均温度值。单位：摄氏度每秒，符号：℃。
3.9平均降温速率mean cooling rate
降温过程中模块单位时间内下降的平均温度值。单位：摄氏度每秒，符号：℃。
3.10荧光染料fluorochrome
由短波长激发光激发，释放出可见光的试剂。[YYT1173-2010,术语和定义3.12]。
3.11荧光强度精密度precision of fluorescence intensity
对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度检测，其检测值的一致性。
3.12阚值循环数Ct(Cp)cycle threshol,crossing point
均热块测量孔内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3~一15个循环的荧光值的10倍标准差为阀值，当荧光值超过阀值时的循环数则为阀值循环数(Ct)。[YYT1173-2010,术语和定义3.15)]。
3.13阀值循环数精密度precision of threshold cycle
均热块不同测量孔在同一荧光条件下，阀值循环数重复测量的一致性。
3.14熔解温度melt temperature,Tm
全总DNA双螺旋结构降解一半时的温度称为熔解温度。单位：摄氏度，符号：℃。
3.15熔解曲线melt curve
PCR过程中均热块测量孔的荧光强度（纵坐标）与温度（横坐标）形成的曲线。
3.16熔解温度漂移melt temperature bias
根据熔解曲线计算的熔解温度值与光学标准器熔解温度设定值之差。单位：摄氏度，符号：℃。
3.17峰值强度peak intensity
熔解曲线上熔解温度对应的荧光强度。
3.18通道峰值强度一致性channel peak height consistency,.CPHC
熔解曲线上，所有采样测量孔峰值强度的变化趋势。峰高的差异表明荧光定量PCR仪的光路、光学、光学检测和灵敏度的差异，理想的荧光定量PCR仪，CPHC为1.00。
3.19线性灵敏系数1 inear sensitivity factor,.LSF
同一熔解温度下，表征熔解曲线线性变化灵敏程度的比率。
注：理想的荧光定量PCR仪，线性灵敏度应该是1.00。LF在0.80和1.20之间，落解曲线呈现基本线性：LSF0.80:在高荧光强度下线性降低，注意信号饱和：LSF>1.20:在低荧光强度下线性降低，注意最小伯号检测和灵敏度。
3.20熔解温度比ratio of melt temperature,RTm
同一熔解温度下，表征熔解温度飘移因素的比率。
注：T.在0.80到120之问：相同产品溶解温度不同，差异仅基于控温摸块特性，溶解峰深移与沿度不均匀直接相关：RT>】20:相同产品溶解温度不同，差异是由控温棋块、光学和光学检测系统不准确共同导致的：RT<0.80:相同产品熔解沿度不同，差异是与光学、光学检测系统及分析软件直接相关。
3.21样本示值误差error of sample's indication
一次融冻转换过程结束到下次冻-融转换过程开始之间的过程。
3.22样本线性sample's linearity
系列稀释标准物质扩增C值对浓度对数值的线性回归系数。
4概述
实时荧光定量PCR仪，全称为实时荧光定量聚合酶链反应分析仪(real-time fluorescent quantitative PCR analyzer,RFQ-PCR,以下简称实时荧光定量PCR仪)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个P℃R进程，同时通过标准曲线对扩增基因进行定量分析的仪器。标记有荧光染料的探针与模板基因混合后，完成高温变性、低温复性和适温延伸的热循环后，与模板基因互补配对的探针被切断，荧光染料游离于反应体系中，在特定光激发下荧光染料发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化的荧光信号强度，即可对待测扩增基因进行定量分析，
实时荧光定量PCR仪均热块一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等几种类型，其中96孔板应用最为广泛。其主要由软件控制系统、温度控制模块、荧光检测模块、均热块检测孔组成，详细结构如图1所示。应用于新冠病毒核酸快速检测的仪器检测通量通常不大于16。

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