ICS11.220 CCS B41 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5283—2020 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Nosema bombi 2020-12-30发布 2021-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布 SN/T5283-2020 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 1范围 本文件规定了熊蜂微孢子虫的光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式 反应检测技术. 本文件适用于熊蜂微孢子虫的检疫. 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适 用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义.下列缩略语适用于本文件. PCR聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) Ct循环阈值(Cyele threshold) ddH2O双蒸水(Double-Distillation H2O) DNA脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid) dNTP三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleoside triphosphate) EB溴化乙锭(Ethidium bromide) TBE三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸(Trihydroxymethyl aminomethane-boric acid-ethylene diamine tetraacetic acid TETE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution) 4仪器和设备 4.1捣碎机 4.2光学相差显微镜 4.3高压灭菌锅 4.4PCR仪 4.5荧光PCR仪 4.6高速冷冻离心机 4.7微量移液器(0.5uL~10uL 2HL~20uL 20L~200L 100uL~1000uL) 4.8超净工作台 4.9水平电泳仪 4.10凝胶成像系统 SN/T5283-2020 4.11电子天平（感量0.01g) 4.12冰箱(2℃~8℃和-20℃) 5试剂 5.1水：符合GB/T6682中一级水的规格. 5.2酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录A.1. 5.3三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录A.2. 5.4TE缓冲液. 5.510xPCR缓冲液. 5.6 dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP) 5.7 Taq DNA聚合酶. 5.80.5×TBE缓冲液（配制方法见附录A.3). 5.9上样缓冲液（配制方法见附录A.4). 5.10EB(10mg/mL) 配制方法见附录A.5. 5.11DNA相对分子质量标准物Marker. 5.12DNA纯化回收试剂盒. 5.13普通PCR引物 上游引物Nos-F1:5'-CCA GCA GTA AAC TAT GCC-3； 下游引I物Nos-R1:5'-CTC GAA TCA GGA TTC TCT CAG-3; 5.14荧光PCR引物和探针 上游引I物Nos-F2:5'-GTC TCT CAG GCT CCT TCT CC-3; 下游引物Nos-R2:5'-ATG TGC ACC GCA GAT AAC TA-3’; 探针qPCR-P:FAM-ACC GTT ACC CGT CAC TGC CTT GT-BHQI; 6采样 6.1采样比例 6.1.1当蜂群数量≤10群时，蜂群均采样. 6.1....
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