SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3960—2014 蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Blueberry stunt phytoplasma 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T3960-2014 蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法. 本标准适用于进出境蓝莓树苗木及蓝莓产品中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定. 2蓝莓矮化植原体基本信息 英文名：Blueberry stunt phytoplasma 分类地位：软壁菌门(Tenericutes) 柔膜菌纲(Mollieutes) 非固醇菌原体目(Acholeplasmatales) 非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae) 植原体属(Phytoplasma) lSrI植原体组D亚组. 蓝莓矮化植原体的其他信息参见附录A. 3方法原理 蓝莓矮化植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据. DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法；以植原体核糖体16 S FDNA通用引物进行PCR扩增、 测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据. 4仪器用具和主要试剂 4.1仪器 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台武冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰 箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等. 4.2用具 移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等 4.3主要试剂 4.3.1CTAB缓冲液 CTAB 20g/L Tris-HCI 100 mmol/L(pH 8.0) EDTA 20 mmol/L(pH 8.0) NaCI 1.4 mol/L PVP-40 10g/L 4.3.2PBS缓冲液(0.2mol/LpH7.4) 无水NaH2PO424g SN/T3960-2014 NaOH 4.9g 加水定容至1000mL. 4.3.3其他试剂 DAPI、巴比妥钠、乙酸钠、2%饿酸水溶液、戊二醛、0.1mol/L盐酸苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙 醇、乙醇、琼脂糖、Goldview核酸染料、PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Tag DNA聚合酶、引物等. 5检测鉴定方法 5.1症状观察 5.1.1现场查验 现场对蓝莓苗木进行观察，症状描述参见附录A 选取可疑症状植株样品和随机样品带回实验室 检测. 5.1.2DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mL DAPI溶液(4'，6-二眯 基-2-苯基吲哚)染色，在460m激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的监色荧光信号 表明有植原体存在.因植株内植原体分布不均，故每个样品应选取不同部位的幼嫩材料进行检测. 5.1.3透射电镜观察 将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体.具体方法见 附录B. 5.2DNA提取 处理样品的方法主要为植物组织中植原体基因组DNA提取方法. 取0.1g样品置于预冷的研钵中，在液氮中将样品研磨成粉末状，并迅速转入1.5mL的离心管中. 加入800pL65℃预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混匀，65℃水浴50min 每隔10min轻轻 颠倒混匀一次.冷却至室温，加人等体积的的三氯甲烷：异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，静置10min 4℃10000r/min离心...
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