SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3965-2014 桃色欧文氏菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Erwinia persicina Hao et al. 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3965-2014 桃色欧文氏菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物检疫中桃色欧文氏菌的检疫鉴定方法. 本标准适用于可能携带桃色欧文氏菌的水果、种子以及苗木等繁殖材料的检疫和鉴定. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1809进出境植物种子检疫规程 3方法原理 桃色欧文氏菌(Erwinia persicina Hao et al.)属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、欧文氏菌属 (Erwinia).该病菌可以通过种子进行远距离传播.该病菌的生物学、生理生化和分子生物学特性是 制定本标准的主要依据（见附录A). 4仪器设备和用具 4.1仪器设备 生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、恒温培养箱、PCR仪、电泳 设备及其他常规实验室设备. 4.2用具 剪刀、解剖刀、接种针（环）、镊子、玻棒、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、量筒、移液器. 5主要试剂 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格. 桃色欧文氏菌所用的培养基配方和试剂详见附录B和附录C. 6检疫鉴定方法 6.1田间调查和植株检验 田间调查时采集具可疑症状的植株或果实带回实验室，用清水清洗干净，切取病健交界部位的组 织，用灭菌水冲洗1次，75%乙醇消毒60 无菌水冲洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加少量无菌 1 SN/T3965-2014 水，用无菌玻棒挤压或用无菌剪刀将其剪碎，用接菌环蘸取菌液划线接种于NA培养基平板上，28℃ 培养48h.挑取优势单菌落进行纯化. 6.2种子处理 对来自桃色欧文氏菌发生国家和疫区（见附录A)的种子，按照SN/T1809的规定进行检疫抽样. 随机选取种子15g~100g浸泡在无菌水中（按1：5质量体积比），4℃过夜，并用无菌水清洗种子 2次，将浸泡液和洗液一并回收至离心管中，然后在4℃下6000g离心10min 去上清液，沉淀悬浮于 2mL灭菌水中，分别稀释10、102、103倍后在1/5NA培养基上涂平板.28℃培养24h~72h 每天 观察菌落生长状况，纯化单菌落.或者取每份种子1000粒用无菌水保湿培养种植于温室或光照培养 箱中，生长温度为25℃~28℃，相对湿度大于或等于70%，种子出苗后一周观察植株感病情况.病变 组织处理和病原菌分离培养参照6.1. 6.3病原菌的分离培养 根据附录A桃色欧文氏菌在NA培养基上的菌落特征，挑取可疑的单菌落，在KB培养基或NA培 养基上划线纯化，28℃培养24h~48h 对可疑分离物的菌落特征进行观察和描述记载，并按照6.4、 6.5、6.6步骤操作. 6.4致病性测定 分离纯化的菌株在NA平板上28℃培养48h后，用无菌水配成10CFU/mL~10CFU/mL的新 鲜菌悬液，通过针刺或注射等方法接种健康寄主，用无菌水接种健康植株叶片做阴性对照.置于光照培 养箱内，26℃，相对湿度80%，光照12h 每天观察发...
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