ICS65.020 B16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2249-2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范 Technical specification of molecular detection for pineapple mealybug wilt pathogen 2012-12-07发布 2013-03-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2249-2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范 1范围 本标准规定了菠萝凋萎病病原（包括菠萝凋萎伴随病毒和菠萝杆状病毒）的分子检测方法. 本标准适用于菠萝种苗及大田植株中菠萝凋萎伴随病毒和菠萝杆状病毒的定性检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注月期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 适用本文 SN/T1193基因检验实验室 不 3术语和定义 下列术语和定义适用义本文件 3.1 RES 菠萝凋萎病病原pathogen of pineapple mealybug wilt(PMv) 包括菠萝调菱伴随病毒(Pineapple mral ybugil-virus.PMWaV)和菠萝杆状病毒 (Pineapple bacilliform eirus .PBCov) 其中萝凋萎伴随病毒包括菠萝凋菱伴病毒1号(PMWaV- 1) 菠萝调萎伴随病2号(PMWaV2和菠萝调菱伴随病毒3号(PMWaV3 炫病害病原的分类地 位、寄主范围、危害症状及地理分布参见A1~A.4. 3.2 热休克蛋白70 heat shock protein70 HSP70 分子量约为70k的 类热休克蛋白，是分子伴侣的主要成分，蛋白的跨膜转运及特定构象的维 持等起着重要作用是进化序列保的蛋白之 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR ⊥N 模板基因序列先经高变性成为单链，在DA聚合酶作用和适宜的反条件下，根据模板序列设 计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的段互补序列发牛退火而互相结合，接着在DNA聚合 酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这 一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数护增 3.4 逆转录聚合酶链式反应reverse-transeription polymerase chain reaction RT-PCR RT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA;再以逆转录后的一 段DNA作为模板，以模板DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖 核苷三磷酸存在下，利用依赖于DNA的DNA聚合酶的催化作用.经过数十次变性、退火和延伸的反 应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等手段检测到被 特异性扩增的片段. 3.5 tRNAmet结合区 tRNAme是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA 它负责识别延伸中AUG密码子.tRNAme结合区 1 NY/T2249-2012 为基因间隔区，该结合区为杆状病毒(Badnavirus)所共有. 4原理 根据PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有碱基序列设计特异性引物进行RT- PCR扩增，依据是否分别扩增获得预期的590bp、611bp和499bp的DNA片段，判断样品中是否携带 菠萝凋萎伴随病毒；根据PBCoV的tRNAm结合区特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增，依据 是否扩增获得预期973bp的DNA片段，判断样...
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