ICS11.220 B41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2417-2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法 Polymerase chain reaction (PCR)for detection of Haemophilus parasuis 2013-09-10发布 2014-01-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2417-2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口. 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所. 本标准主要起草人：逯忠新、贺英、储岳峰、赵萍、高鹏程. I NY/T2417-2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法 1范围 本标准规定了检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis HPS)的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction PCR)技术. 本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测. 2材料准备 2.1器材 PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2 mL PCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、 电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱. 2.2试剂 NET缓冲液（配制方法参见A.1)、TAE电泳缓冲液（配制方法参见A.2)、RNase A酶、蛋白酶K、 Tag DNA聚合酶(5U/uL)、10XPCR缓冲液（含Mg2)、脱氧三磷酸核苷酸混合液(dNTPs 各 2.5mmol/uL)、125 bpDNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)、三羟甲基氨基 甲烷(Tis碱)、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、冰醋酸、氯化钠、溴酚蓝、溴化乙锭、十二烷基硫 酸钠(SDS)、灭菌超纯水. 2.3引物 引物序列：F1:5’-TAT CGG GAG ATG AAA GAC-3’;F2:5’-GTA ATG TCT AAG GAC TAG-3’;REvx:5’-CCT CGC GGC TTC GTC-3’.引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20umol/L. 靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3. 2.4样品采集 2.4.1气管分泌物 用灭菌棉拭子蘸取气管分泌物，放入无菌试管中. 2.4.2肺脏 无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品. 2.4.3关节液 若有关节囊肿，在囊肿部位表面常规碘酊消毒，用2mL或5mL灭菌注射器穿刺，无菌吸取1mL~ 2mL关节渗出液. 2.4.4采集的样品 应在4℃条件下立即送到实验室. 2.5DNA提取 2.5.1样品处理 2.5.1.1气管分泌物拭子 将每支拭子浸人1mL~2 mL NET缓冲液中30min 反复挤压.将浸出液经4℃7500g离心 15min后，弃上清.收集沉淀，用1 mLNET缓冲液重悬. 2.5.1.2肺组织 将肺组织样品剪碎，按1g加入0.9LNET缓冲液研磨后，用双层灭菌纱布过滤.收集过滤液于 2mL灭菌离心管，4℃7500g离心15min 弃上清.收集沉淀，用1 mLNET缓冲液重悬. 1 ...
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