ICS65.020.01 B15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2678-2015 马铃薯6种病毒的检测RT-PCR法 Detection of the six potato viruses-RT-PCR method 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2678—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由农业部种植业管理司提出并归口. 本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、湖南农业大学园艺学 院、华中农业大学生命科学技术学院、福建农林大学. 本标准主要起草人：张威、白艳菊、李学湛、柳俊、詹家绥、聂碧华、胡新喜、何长征、高艳玲、范国权、 申宇、张抒、王晓丹、王文重、魏琪、邱彩玲、耿宏伟、董学志、万书明. I NY/T2678-2015 马铃薯6种病毒的检测RT-PCR法 1范围 本标准规定了马铃薯S病毒(Potato virus S PVS)、马铃薯X病毒(Potato virus X PVX)、马铃薯 M病毒(Potato virus M PVM)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus PLRV)和马铃薯A病毒(Potato virus A PVA)的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分子 生物学检测方法（见附录A). 本标准适用于马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯块茎、植株等组织中病毒的检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 本标准采用反转录一聚合酶链式反应(reverse-transcription polymerase chain reaction RT-PCR) 方法检测马铃薯病毒.其原理是，将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的 技术，RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA 再以cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下进 行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定病毒的目的. 4试剂和材料 以下试剂，除非另有规定仅使用分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水. 4.1 TRIzol RNA提取试剂 4.2三氯甲烷 4.3异丙醇 4.475%乙醇 量取无水乙醇75mL 加水定容至100mL. 4.5M-MLV反转录酶(200U/L) 4.6RNA酶抑制剂(40U/L) 4.7 Tag DNA聚合酶(5U/L) 4.8 10 x PCR buffer(Mg?free) 4.9 MgCl2(25 mmol/L) 4.10dNTP混合物（各2.5mmol/L) 4.11焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水 在100mL水中，加人焦碳酸二乙酯(DEPC)50uL 室温过夜，121℃高温灭菌20min 分装到 1.5 mL DEPC处理过的离心管中. 4.1210×TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷(Tis)242g 冰乙酸57.1mL 乙二胺四乙酸二钠2H2O37.2g 用氢氧化钠调 pH至8.5，加水定容至1000mL. 1 ...
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