ICS65.020 B16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2729-2015 李属坏死环斑病毒检测规程 Criterion for prunus necrotic ringspot virus detection 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2729—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由农业部种植业管理司提出并归口. 本标准起草单位：农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）、云南省农业科学院花卉研究所、 国家观赏园艺工程技术研究中心、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心. 本标准起草人：王丽花、粗素萍、王继华、杨秀梅、吴学尉、王其刚、张艺萍、张丽芳、苏艳、彭绿春. I NY/T2729-2015 李属坏死环斑病毒检测规程 1范围 本标准规定了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus PNRSV)的双抗体夹心酶联免疫 吸附检测法(DAS-ELISA)和指示植物检测法. 本标准适用于植物组织中李属坏死环斑病毒的检测. 2取样 根据样品属性，取发芽幼苗、腋芽、枝条韧皮部、果实表皮、叶片、鳞片外表皮等器官或组织，洁净水 洗净后备用. 3检测方法 3.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA) 3.1.1原理 利用抗原（病毒）与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理.即存在于样品中的病毒颗 粒首先被吸附在酶联板孔中的单克隆抗体捕捉后，再与碱性磷酸酯酶标二抗结合反应，后加入碱性磷酸 酶底物，酶将底物水解并产生有色产物.颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比，若样品不携带病毒则 无颜色反应. 3.1.2仪器、用具及耗材 酶标仪（配405nm滤光片），恒温培养箱（温度可调范围0℃~40℃），生物培养箱（具光照、温度可 调范围0℃~50℃)，电子天平（感量为0.01g、0.0001g) 酸度计.微量移液器(200μL~1000μL 10uL~100μL 0.5μL~10uL) 酶联板，研钵或自封袋，微量移液器吸头，离心管等. 3.1.3试剂 3.1.3.1所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水. 3.1.3.2抗体和对照 PNRSV抗体、阳性对照、阴性对照或DAS-ELISA检测试剂盒均来自市售. 3.1.3.3包被缓冲液(pH9.6 贮藏于4℃) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO) 2.93g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 加蒸馏水溶解定容至1000mL. 3.1.3.4洗涤缓冲液(PBST pH7.4) 氯化钠(NaC1) 8.0g 无水磷酸二氢钾(KH2PO) 0.2g 无水磷酸氢二钠(Na2HPO) 1.15g 氯化钾(KC1) 0.2g 吐温-20(Tween-20) 0.5g 加蒸馏水溶解定容至1000mL. 3.1.3.5样品提取缓冲液(GEB PH7.4 贮藏于4℃) ...
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