ICS65.020 B16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2810-2015 橡胶树褐根病菌鉴定方法 Methods for identification of Phellinus noxius(Corner)G.H.Cunn of rubber tree 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2810-2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由农业部农垦局提出. 本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口. 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所、厦门出入境检验检疫局. 本标准主要起草人：贺春萍、梁艳琼、林石明、李锐、吴伟怀、郑肖兰、郑金龙. I NY/T2810-2015 橡胶树褐根病菌鉴定方法 1范围 本标准规定了橡胶树褐根病菌(Phellinus noxius)的术语和定义、鉴定依据、试剂及配制方法、采 样、症状鉴定、培养鉴定、PCR鉴定、结果判定、标本和样品保存等技术要求. 本标准适用于橡胶树褐根病菌(P.oxius)的鉴定. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T28095木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3.1 橡胶树褐根病brown root disease of rubber tree 由有害层孔菌[Phellinus noxius(Corner)G.H.Cunn]引起的一种为害橡胶树根部的真菌病害.该 病害病原菌的危害症状和培养性状见附录A. 4鉴定依据 依据褐根病菌在橡胶树上的为害症状、形态特征、室内病原菌培养性状以及PCR特异性反应进行 鉴定.根据褐根病菌核糖体基因内转录间隔区(DNA-ITS)特有碱基序列设计特异性引物进行PCR 扩增.依据是否扩增获得预期653bp的特异DNA片段，判断样品中是否携带橡胶树褐根病病菌. 5试剂及配制方法 5.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 称取200g洗净去皮的马铃薯，切碎，加一级超纯水900mL煮沸30min 纱布过滤，再加20g葡萄 糖（化学纯）充分溶解后，用一级超纯水定容至1000mL 分装后，每100mL培养基中加入2.2g琼脂粉 (高纯度)，121℃高温灭菌20min 4℃或室温保存备用.马铃薯葡萄糖液体培养基不加琼脂粉. 5.2试剂 琼脂粉、葡萄糖、无菌水、75%酒精、氯化钠、0.1%升汞、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-N2)、氢氧化 钠(NaOH)、三羟甲基氨基甲烷(Tis)、冰乙酸、四环素、链霉素、异丙醇、无水乙醇、真菌DNA提取试剂 盒、琼脂糖、液氮、蒸馏水、Tag DNA聚合酶、引物、DNA纯化试剂盒、PCR产物回收试剂盒、PMD18-T Vector.、感受态细胞、Golden view核酸染料、DL2000 Marker、TAE电泳缓冲液等. 5.3试剂配制 5.3.1四环素(Tetracycline) 称取0.1g四环素溶解于无水乙醇，定容至10mL.以50μg/mL终浓度添加于生长培养基. 5.3.2链霉素(Streptomycin) 称取0.5g链霉素硫酸盐溶解于足量的无水乙醇中，最后定容至10mL.以100μg/mL的终浓度 1 ...
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