ICS11.220 B41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T772-2013 代替NY/T772一2004 禽流感病毒RT-PCR检测方法 RT-PCR detection method for avian influenza viruses 2013-09-10发布 2014-01-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T772-2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准代替NY/T772一2004《禽流感病毒RT-PCR试验方法》. 本标准与NY/T772一2004相比，主要变化如下： 一将原标准名称中“试验方法”改为“检测方法”； 一将原标准中两套操作标准，合并成一套操作标准； 一将原标准中异硫氰酸胍提取RNA方法，改用商品化RNA提取试剂提取方法； 一将原标准中RT-PCR检测模式，改为商品化一步法RT-PCR试剂盒的检测模式； 一一更新了检测H7亚型禽流感病毒的引物序列，新增通用型HA和NA基因全长的RT-PCR检 测方法； 一更新了RT-PCR扩增产物与加样缓冲液进行混合的方法； —增设检测流程，说明如何搭配使用此标准中含有的多对引物，实现不同的检测目的. 本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口. 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心. 本标准主要起草人：王秀荣、刘朔、陈继明、蒋文明、包红梅、陈化兰. 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -—NY/T772—2004. I NY/T772-2013 禽流感病毒RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了禽流感病毒型特异性RT-PCR(反转录-一聚合酶链式反应)检测技术（各亚型通用）， 以及禽流感病毒H5、H7、H9血凝素(HA)亚型和N1、N2神经氨酸酶(NA)亚型的RT-PCR检测技 术. 本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和禽胚尿囊液中禽流感病毒的核酸. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T18936高致病性禽流感诊断技术 3实验室条件 3.1仪器 PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴箱等. 3.2操作区域 样品处理区要有相应的生物安全设施；RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净；电泳区要 其他操作区域相互隔离. 3.3操作者 操作者应接受过RT-PCR技术培训；熟悉防止RNA降解、核酸污染和溴化乙锭污染的具体措施； 熟悉RT-PCR检测结果的判断方法. 4试剂的准备 4.1试剂 4.1.1商品化的RNA提取试剂盒. 4.1.2商品化的一步法RT-PCR试剂盒. 4.1.31.5%琼脂糖凝胶，见A.1. 4.1.41XTAE缓冲液：见A.2. 4.1.5溴化乙锭(10μg/μL) 见A.3. 4.1.6核酸电泳加样缓冲液，见A.4. 4.1.7商品化的DNA分子量标准，要求在100bp~1000bp之间有5条以上的指示条带. 4.1.8用已知的含有与RT-PCR检测引物（附录B)相对应的且灭活的禽流感病毒制作的阳性对照标 准品（来自商品化试剂盒或者省部级以上的实验室）. 4.1.9用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品. 4.2引物 序列见附录B 浓度均为10umol/L 在RT-PCR反应体系的最终浓度是0.4umol/L. 1...
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