B 41 ICS 65.020.30 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T7223.4-2017 黏孢子虫病诊断规程 第4部分：吉陶单极虫 Protocols for diagnosis of myxosporidiosis-- Part 4:Disease caused by Thelohanellus kitauei 2017-06-12发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布
SC/T 7223.4-2017 前言 SC/T7223《黏孢子虫病诊断规程》拟分为如下部分： 第1部分：洪湖碘泡虫； 第2部分：吴李碘泡虫； 第3部分：武汉单极虫； 第4部分：吉陶单极虫。
本部分为SC/T7223的第4部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本部分由农业部渔业渔政管理局提出。
本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。
本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所。
本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。
SC/T 7223.4-2017 黏孢子虫病诊断规程 第4部分：吉陶单极虫 1范围 本部分给出了鲤（Cyprinuscarbio）患吉陶单极虫病的临床症状，规定了吉陶单极虫（Thelohanel- luskitauei)的采集、固定与标本制作，形态学鉴定和分子检测的方法，以及吉陶单极虫病的综合判定。
则和检疫。
2规范性引用文件 必 可少的。
凡是注日期 的 注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改 SC/T 7103水生动物 产地检疫采样技术规范 3试剂和材料 3.1水：符合GB/T 3682中一级水 的规格 R 3.2乙醇：分析纯 3.3Taq酶：- 20℃保存，避免反复冻融。
3.4dNTPs:含dATP 3.5上游引物：5 CGGAC 下游引物：5 本对引物扩增核糖体小亚基 3.6 DNA marker 2 deo(bp) 000 3.7其他试剂见附录 4仪器和设备 4.1解剖盘、剪刀、镊子、解剖针和解剖刀 4.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。
4.3盖玻片、载玻片和培养Ⅲ。
4.4电子天平。
4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。
4.6普通冰箱。
4.7微量移液器。
4.8PCR扩增仪。
4.9离心管和PCR管。
4.10紫外透射仪或凝胶成像系统。
4.11水平电泳系统。
SC/T 7223.4-2017 5感染对象与临床症状 5.1感染对象 吉陶单极虫感染鲤。
5.2临床症状 吉陶单极虫寄生于鲤的肠道内，病鱼在池边独游，行动迟缓，不摄食，鱼体发黑消瘦；腹部稍隆起，肠 道呈结节型膨大，形成瘤状；肠壁变薄，有腹水。
6吉陶单极虫的采集、固定与标本制作 6.1病鱼采集 观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符 合SC/T7103的规定。
6.2样品的采集 剖开腹部，剪开肠道的膨大处，用镊子取出包囊，置于培养皿中。
6.3样品的固定 用10%中性福尔马林溶液（见A.1)固定黏孢子虫包囊团或孢子，或用100%乙醇保存。
6.4样品的标本制作 将黏孢子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液（见A.2)，盖上盖玻 片，用于显微镜观察。
7吉陶单极虫的鉴定 7.1吉陶单极虫形态学鉴定 根据显微镜内的测微标尺测量孢子和极囊的大小，吉陶单极虫孢子的形态特征见附录B。
成熟孢 子壳面观为长梨形，前端尖窄，近似圆锥体，后端钝圆，孢子外部具透明薄膜鞘；孢子长23.0um～28.0 μm，宽7.9μm～11.0μm，厚8.3um～10.6um；极囊1个，形状与孢子相似，长度约为孢子长的3/5，极 丝盘成8圈~10圈。
如果孢子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似吉陶单极虫。
7.2吉陶单极虫分子检测 7.2.1虫体DNA的提取 将用100%乙醇固定的孢子(有包囊的用清水冲洗，去除表面组织)充分干燥去除乙醇，置于1.5mL 的离心管中，加人0.5mL裂解缓冲液（见A.6），55°℃下过夜。
冷却至室温后，加入500μLDNA抽提 缓冲液（见A.7)，摇匀，5200g离心10min，收集上清液。
然后加人0.1倍体积的乙酸钠缓冲液（见 沉淀2次，弃上清液，空气干燥后溶于40μLTE缓冲液（见A.4)中，一20℃保存备用。
7.2.218SrDNA的PCR扩增 在50μL的PCR反应体系中，包含模板基因组DNA10ng～50ng、1.5U...
