BJS 食品补充检验方法 B.JS202309 鸭血中鸭鸡鹅源性成分的测定 2023-06-13发布 国家市场监督管理总局发布 B.JS202309 鸭血中鸭鸡鹅源性成分的测定 1范围 本方法规定了鸭血及鸭血制品中鸭、鸡、鹅源性成分的液滴数字PCR定量测定方法. 本方法适用于鸭血及鸭血制品中鸭、鸡、鹅源性成分的液滴数字PCR定量测定. 2原理 将试样进行干燥等前处理后，提取基因组DNA 以核基因组单拷贝基因RPAI为靶基因，利用特 异性引物和探针进行双重液滴数字PCR扩增，检测出试样中鸭和鸡（或鹅）源性成分的靶基因拷贝数， 通过建立鸭和鸡（或鹅）之间靶基因拷贝数比与质量比的标准曲线，实现鸭血及其制品中鸭、鸡、鹅源性 成分的定量检测. 3试剂和材料 除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682的一级水要求.试剂均 用无DNA酶污染的容器分装. 3.1引物和探针序列 引物和探针序列见表1. 表1引物和探针序列 物种 引物和探针 序列 上游引物 5'-GCAACAGGAACTGGCTGAGTG-3' 鸭 下游引物 5'-AATTACTGTTCCTCTTGTGTCAGAAA-3' 探针 5'-FAM-AGTCAGCAGCTCCAACGCATGCTG-BHQ1-3' 上游引物 5'-CAGAACCACACTCAACCTGTCTGA-3' 鸡 下游引物 5-TCGGGGAAATGTCTTACTGCAAG-3' 探针 5-HEX-CTCCTAGCAGCCTGTGCCAAGGCCA-BHQ1-3' 上游引物 5'-ACGAGGATAGGTTGTGACAGC-3' 鹅 下游引物 5'-GAATCTCTGTGTCGTCTTCTCTATATG-3' 探针 5'-HEX-ACTCTGTTCAGCCTTGCGAAGACCTTATGC-BHQ1-3' 注：靶基因名称及NCBI数据库序列号见附录A. 3.2DNA提取试剂盒 选择适用于鸭、鸡、鹅组织DNA提取的商品化基因组DNA提取试剂盒. 3.3液滴数字PCR预混液(2X) 含有镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和具有5→3外切活性的热启动Tag DNA聚合酶的 数字PCR专用预混试剂，推荐按照不同的液滴数字PCR仪说明书选择. 1 BJS202309 3.4磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液) 称取8.0g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KC)、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO)、0.24g磷酸二氢钾 (KH2PO)溶于800mL蒸馏水中，用1mol/LHCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水稀释至1L即可 得0.01mol/LPBS缓冲液.1mol/LHC1溶液配制方法：量取90mL盐酸，缓慢加水至1000mL 摇匀. 3.5蛋白酶K:20mg/mL 一20℃保存备用. 4仪器和设备 4.1液滴数字PCR仪（含液滴生成器）. 4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计. 4.3恒温水浴装置. 4.4高速冷冻离心机：离心力12000g. 4.5微量移液器(0.1L~2.5L、0.5gL~10gL、10L~100L、20L~200L、100L~1000L). 4.6涡旋混合器. 4.7天平：感量0.001g. 4.8恒温干燥箱. 4.9研钵或组织研磨仪. 4.10pH计. 4.11生物安全柜. 5分析步骤 5.1试样前处理 称取50g样品，放置于80℃恒温干燥箱中6h~8h 烘干水分，用研钵或组织研磨仪研磨成粉状. 称取10mg研磨后样品，加入970 L PBS缓冲液和20uL蛋白酶K 置恒温水浴...
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