ICS11.220 B41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T27532-2011 犬瘟热诊断技术 Diagnostic techniques for canine distemper 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27532—2011 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录. 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口. 本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民 共和国山东出入境检验检疫局. 本标准主要起草人：单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶. I GB/T27532-2011 犬瘟热诊断技术 1范围 本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT- PCR检测的操作方法. 本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测.其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组 织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断. 2试剂和材料 2.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配方参见附录A. 2.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞). 2.3磷酸盐缓冲液(PBS):配制参见附录A. 2.4青霉素、链霉索：配方参见附录A. 2.5CDV阳性血清：中和抗体效价1：1024. 2.6CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清. 2.7酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA). 2.8底物溶液：配制参见附录A. 2.9过氧化氢甲醇溶液：配制参见附录A. 2.10盐酸酒精溶液：配制参见附录A. 2.11胰蛋白酶溶液：配制参见附录A. 2.12Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/pL 一20℃保存. 2.13逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U/μL 一20℃保存. 2.14RNA酶抑制剂(40U/μL):一20℃保存. 2.15dNTP:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L 一20℃保存. 2.16引物：浓度为20μmol/L 其序列如下： 上游引物(CDVF):5'CGA GTC TTT GAG ATA GGG TT3'; 下游引物(CDVR):5'CCT CCA AAG GGT TCC CAT GA3'. 2.17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50μmo1/L 一20℃保存. 2.18DEPC水：自配（参见附录A) 或购买商品化DEPC水. 2.19 Trizol试剂：4℃保存. 2.20异丙醇：使用前预冷至一20℃. 2.2175%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃. 2.221.5mL无RNA酶的Eppendorf管. 2.230.2mL无RNA酶的PCR薄壁管. 3器材和设备 3.1细胞培养瓶（中号瓶）. 3.2二氧化碳培养箱. 3.3恒温水浴箱(5℃~100℃). 3.4普通光学显微镜. ...
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