ICS11.220 B41 GB 中华人民共和国国家标准 .GB/T27538—2011 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 Animal influenza detection-Method of pyrosequencing for HA and NA in influenza virus A (H1N1) 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27538-2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口， 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院. 本标准主要起草人：徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林样梅、韩雪清、 朱来华、张鹤晓、单虎. I GB/T27538-2011 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 1范围 本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型H1N1流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸 序列检测方法. 本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541动物疫病实验室检验采样方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件. ATP:三磷酸腺苷(adenosine triphosphate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PBS:磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate belanced solution) Pyrosequencing:焦磷酸测序 RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction) RNA:核糖核酸(ribonucleic acid) Taq酶：Taq DNA聚合酶 4原理 焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS)、荧光素孵育，逐一加入四种dNTPs(dATP dTTP dCTP dGTP) 如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi);ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP ATP驱动荧光索酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧 光素发出与ATP量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰. 每个光信号的峰高与反应中接人的核苷酸数目成正比.ATP和未接入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸 酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系. ...
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