ICS11.220 B41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of classical swine fever virus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T27540-2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本标准由中华人民共和国农业部提出， 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口. 本标准起草单位：中国兽医药品监察所. 本标准主要起草人：王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启. I GB/T27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒(Classical swine fever virus CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法， 本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CFV核 酸的检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 中华人民共和国农业部公告第302号善医实验室生物安全技术管理规范 3缩路语 下列缩略语适用于本文件. CSFV:猪瘟病毒(Classical swine fever virus) Ct值：达到值的循环数(cycle threshold) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) HS Taq酶：热启动Taq DNA聚合酶(HS Taq DNA polymerase) RNA:核糖核酸(ribonucleic acid) 荧光RT-PCR:荧光逆转录聚合酶链式反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) 4试剂和材料 除另有说明，所用试剂均为分析纯；试剂均用无RNA酶的容器分装. 4.1 Trizol:RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃~8℃保存. 4.2氯仿：4℃预冷. 4.3异丙醇：4℃预冷. 4.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷. 4.5DEPC水：去离子水中加人0.1%DEPC 37℃作用1h (121士2)℃，高压灭菌15min. 4.6RNA酶抑制剂(30U/μL). 4.7 10XPCR buffer (10 mmol/L pH8.3Tris-HCI 50 mmol/L KCI 1.5 mmol/L MgCl). 4.8 dNTP(2.5 mmol/L). 4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmo1/L 探针浓度为5Amol/L 其序列如下： 上游引物F:5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-3 1 ...
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