ICS65.020 B61 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1730-2009 食用菌菌种真实性鉴定ISSR法 Verification of genuineness for edible mushroom spawn-ISSR 2009-04-23发布 2009-05-20实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T1730—2009 食用菌菌种真实性鉴定ISSR法 1范围 本标准规定了ISSR技术鉴定食用菌菌种真实性的方法. 本标准适用于对糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinula edodes)、黑木耳(Auicularia au- ricula)、白灵菇(Pleurotus nebrodensis)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、白黄侧耳(Pleurotus cornucopi- ae)、肺形侧耳(Pleurotus pulmomarius.)、佛州侧耳(Pleurotus floridanus)、灰树花(Grifola frondosa)、 金针菇(Flammulina velutipes)、滑菇(Pholiota nameko)、茶树菇(Agrocybe cylindracea)、鸡腿菇 (Coprinus atus)等食用菌菌种真实性的鉴定，包括母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）. 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准. NY/T1097一2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法 3原理 ISSR方法是以错定微卫星DNA为引物，即在微卫星DNA序列的3'端或5'端加上2个~4个随机 核苷酸，对基因组DNA进行PCR扩增，得到与锚定引物互补的重复序列的区间DNA片段.不同物种 基因组DA中的这种反相重复的微卫星序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定结合位点 分布发生相应的变化，从而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变.通过对PCR产物的检测和比 较，即可识别样本基因组DNA的多态片段，从而鉴定样本的真伪. 4试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水. 4.170%乙醇溶液：见附录A.1. 4.21mol/L Tris-HCl(pH8.0):见附录A.2. 4.30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液：见附录A.3. 4.4CTAB提取缓冲液：见附录A.4. 4.5TE缓冲液：见附录A.5. 4.650×TAE缓冲液：见附录A6. 4.7加样缓冲液：见附录A7. 4.8核酸染料，按使用说明操作. 4.9苯酚一三氯甲烷一异戊醇溶液=25十241. 4.10三氯甲烷一异戊醇溶液=24十1. 4.11无水乙醇 4.12四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液. 4.13 Tag DNA聚合酶. 4.1410XPCR反应缓冲液. NY/T 1730—2009 4.15 DNA分子量标记. 4.16引物：参见附录B 5仪器 5.1紫外分光光度计. 5.2高速冷冻离心机（转速不小于10000r/min). 5.3高压灭菌锅. 5.4PCR扩增仪. 5.5电泳仪. 5.6电泳槽. 5.7紫外透射仪. 5.8凝胶成像系统或照相系统. 6操作步骤 6.1DN...
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