ICS11.220 B41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1873-2010 日本脑炎病毒抗体间接检测 酶联免疫吸附法 Indirect ELISA for antibody detection of Japanese encephalitis virus 2010-05-20发布 2010-09-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T1873-2010 日本脑炎病毒抗体间接检测酶联免疫吸附法 1范围 本标准规定了日本脑炎病毒抗体的间接ELISA检测技术操作程序. 本标准适用于进出口检疫及流行病学调查时对猪血清中日本脑炎病毒抗体的检测. 2间接ELISA 2.1材料准备 2.1.1器材 37℃恒温培养箱、微量移液器、震荡混匀仪、酶标仪、酶标板等. 2.1.2包被抗原 包被用抗原为日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ重组蛋白(re-DⅢ)，经大肠杆菌表达后亲和层析纯 化而成.每孔包被量为100ng. 2.1.3阴性对照血清 SPF猪血清，经PH7.4的磷酸盐缓冲液（附录A)1:40稀释后作为阴性对照血清. 2.1.4阳性对照血清 日本脑炎病毒疫苗免疫健康猪，抗体中和效价达到1：640时采血分离血清，将中和效价为1：640 的阳性血清用H7.4的磷酸盐缓冲液（附录A)作1：160稀释，即为阳性对照血清. 2.1.5包被液、洗涤液、封闭液、酶标抗体稀释液、底物液、终止液 配制方法见附录A. 2.1.6检测前，先将各种试剂材料平衡至室温. 2.2操作方法 2.2.1抗原包被 以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原（将re-DⅢ重组抗原稀释至1pg/mL) 按每孔100uL包被酶 标板，37℃作用2h后，洗涤液(PBST)洗板3次，每次5min. 2.2.2封闭 每孔加入200L封闭液，37℃封闭2h 洗板同上. 2.2.3加待检血清及对照血清 以H7.4的磷酸盐缓冲液作为样本稀释液，将待检血清按1：40稀释后100L/孔加样，每板同 时设置两孔阴性血清对照、两孔阳性血清对照，并设一孔空白对照.37℃作用1h 洗板同上. 2.2.4加酶标抗体 每孔加入工作浓度的100L兔抗猪酶标抗体，37℃作用1h 洗板同上. 2.2.5加底物液 每孔加人底物液100uL 37℃显色作用10min. 2.2.6加终止液 每孔加入100L终止液终止反应，15min之内测定OD45值. 2.2.7结果判定 在酶标仪上读出OD46的值.以空白值调零，计算阳性对照OD45平均值、阴性对照OD450平均值. I NY/T1873-2010 附录A (资料性附录) 溶液的配制 A.1包被液（碳酸盐缓冲液，pH9.6) NaHCO3(分析纯) 2.98g Na2CO(分析纯) 1.5g 定容至1000mL 混匀. A.2洗涤液(PBST PH7.4) NaCl(分析纯) 8.0g KH2PO (分析纯) 0.2g Na2HPO4I2H2O(分析纯) 2.9g KC1(分析纯) 0.2g Tween20(分析纯) 0.5mL 硫柳汞（分析纯） 0.1g 加双蒸水至1000mL 调至pH7.4. A.3封闭液(1%BSA/PBST溶液，PH7.4) BSA(生物技术级)5g 加PBST至500mL. A.4磷酸盐缓冲液(pH7.4) NaCl(分析纯) 8.0g KH2PO(分析纯) 0.2g Nag HPO412H2O(分析纯) 2.9g KCI(分析纯) 0.2g 硫柳汞（分析纯） 0.1g 加双蒸水至1000mL 调至pH7.4. A.5酶标抗体稀释液 将小牛血清10mL加...
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