ICS65.020.30 B43 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1903-2010 牛胚胎性别鉴定技术方法PCR法 Procedures for sex identification of bovine embryos-PCR techniques 2010-07-08发布 2010-09-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T1903-2010 牛胚胎性别鉴定技术方法PCR法 1范围 本标准规定了聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定胚胎性别的操作方法. 本标准适用于普通牛(Bos taurus)胚胎性别鉴定. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于木文件. GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3原理 从被检胚胎中取出部分细胞，提取DNA 利用Y染色体上的特异序列设计引物进行扩增和检测， 根据扩增结果鉴定性别. 4取样 4.1胚胎预处理 冷冻胚胎在室温下停留10s:然后32℃温育20s 用胚胎清洗液将附着在胚胎周围的细胞与碎片彻 底洗除，待用；新鲜胚胎直接用胚胎清洗液将附着在胚胎周围的细胞与碎片彻底洗除，待用. 4.2胚胎细胞取样 4.2.1显微分割法 应用显微操作仪切开透明带，取出4个~8个胚胎细胞. 4.2.2徒手分割法 先用0.1%~0.2%链霉蛋白酶软化透明带，在实体显微镜下，用切割针切割胚胎，取出4个~8个 细胞胚胎细胞. 5鉴定 5.1试剂和仪器设备 试剂和仪器参见附录A. 5.2鉴定过程 5.2.1DNA提取 5.2.1.1蛋白酶K消化法 将胚胎细胞移入PCR管中，加入200gL~500gL胚胎裂解液，55℃消化15min~30min 95℃~ 98℃灭活蛋白酶K5min~10min 10000×g离心30s~45s 取上清液作为PCR反应模板. 5.2.1.2加热释出法 将胚胎细胞移人PCR管中，加入200L~500uL灭菌双蒸水，100℃煮沸10min 10000×g离心 30s~45s 取上清液作为为PCR反应模板. 1 NY/T1903-2010 5.2.1.3液氮反复冻融法 将胚胎细胞移入PCR管中，加入200μL~500L灭菌双蒸水，用液氮反复冻融几次，10000×g离 心30s~455 取上清液作为PCR反应模板. 5.2.2目的基因片段PCR扩增 5.2.2.1引物制备 引物1序列（牛Y染色体重复序列引物）： 引物1F5-GAT CAC TAT ACA TAC ACC ACT-3; 引物1R5’-GCT ATG CTA ACA CAA ATT CTG-3'. 引物2序列（牛特异性DNA序列的引物）： 引物2F5-TGG AAG CAA AGA ACC CCG CT-3'; 引物2R5’-TCG TCA GAA ACC GCA CAC TG-3'. 将合成的引物瞬时离心，加人灭菌双蒸水，室温溶解30min 分装，一20℃冷冻保存.其中，加入灭 菌超纯水的体积V(L) 按式(1)计算： V 33×ODX10 (1) MW 式中： MW一引物分子量； OD—DNA260nm吸收的光密度. 5.2.2.2PCR反应体系 PCR反应体系见表1. 表1PCR反应体系 组分及浓度 使用量 10Xbuffer 1.5uL MgCl(25 mmol/L) 0.9gL~1.5L dN...
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