NY/T 1951-2010 蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范.pdf

ICS11.220 B41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1951-2010 蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范 Protocol of diagnosis for foulbrood disease 2010-09-21发布 2010-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T1951-2010 蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范 1范围 本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病及蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法. 本标准适用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病及蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断和检疫. 2蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法 2.1原理 蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American foulbrood disease)是由幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae lar- ae White)引起蜜蜂幼虫和蛹的急性和毁灭性细菌性病害，主要侵害西方蜜蜂. 2.2试剂、设备和材料 2.2.1材料和试剂 2.2.1.1无菌平皿. 2.2.1.2载玻片. 2.2.1.3试管(10mL). 2.2.1.4微量移液器. 2.2.1.5小离心管(1.5mL). 2.2.1.6PCR管(200L). 2.2.1.7胡萝卜酵母培养基. 2.2.1.8马铃薯培养基. 2.2.1.9酵母浸膏培养基. 2.2.1.10牛肉膏琼脂平板. 2.2.1.115%孔雀绿水溶液. 2.2.1.120.5%沙黄水溶液. 2.2.1.13碱性美蓝（又称骆氏美蓝）染色液. 2.2.1.142%石炭酸复红染液. 2.2.1.155%的醋酸. 2.2.1.16无菌生理盐水. 2.2.1.17无菌蒸馏水. 2.2.1.18PCR引物. 2.2.1.19Taq聚合酶. 2.2.1.2010XPCR缓冲液. 2.2.1.21dNTP. 2.2.1.220.8%琼脂糖凝胶. 2.2.1.23TAE电泳缓冲液（见表1）. 1 NY/T1951-2010 表1TAE电泳缓冲液参数 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸(TAE) 1X:0.04mol/L Tris乙酸 50X:242 g Tris碱 0.001 mol/L EDTA 57.1mL冰乙酸 100 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2.2.1.24琼脂糖凝胶和凝胶加样缓冲液. 0.8%琼脂糖凝胶配置：2.4g琼脂糖，加入200 mL TAE电泳缓冲液，加热溶解后，用TAE电泳缓 冲液定容至300mL 略冷后加入15L溴化乙啶(EB)溶液，混匀. 加样缓冲液配制见表2. 表2加样缓冲液配置 0.25%溴酚蓝 40%(W/V蔗糖水溶液 2.2.2设备 2.2.2.1普通光学显微镜. 2.2.2.2恒温培养箱. 2.2.2.3恒温水浴箱. 2.2.2.4高速离心机. 2.2.2.5PCR仪（热循环仪）. 2.2.2.6琼脂糖凝胶电泳仪. 2.2.2.7紫外凝胶成像系统. 2.3方法及判定 2.3.1症状诊断法 幼虫的巢房盖变潮湿、下陷，颜色发暗并显油光，大部分穿孔；封盖幼虫死亡，死亡的蛹的喙常从腐 烂虫尸前端穿出，形如伸出的舌状；若揭开房盖，用一根火柴杆插入虫体再拉出来，可拉出2cm~3cm 长的胶体状细丝.病死幼虫的尸体大约一个月后干枯成一片难以剥落的皮，贴在房壁上. 2.3.2微生物学诊断法 2.3.2.1取备检幼虫样品1只~2只置于组织研磨器内，加1mL~2mL灭菌生理盐水制成悬浮液. 2.3.2.2将上述悬浮液（也可将悬浮液在80℃水浴中10min 以杀死不形成芽孢的细菌再接种）接种 于胡萝卜酵母琼脂（参见A.1)平板培养基或马铃...