ICS 65.020 B15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2114-2012 大豆疫霉病菌检疫检测与鉴定方法 Detection and identification ofPhytophthora sojaeKaufmann& Gerdemann 2012-02-21发布 2012-05-01实施 中华人民共和国农业部发布
NY/T2114-2012 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出。
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)归口。
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、黑龙江省植检植保站。
本标准主要起草人：王福祥、陈继光、王源超、项宇、焦晓丹、熊红利、戴婷婷、隋广义、杜淑梅、朱莉。
NY/T 2114-2012 大豆疫霉病菌检疫检测与鉴定方法 1范围 本标准规定了大豆疫霉病菌的现场和室内检疫检测及鉴定方法。
本标准适用于大豆植株、土壤样品以及大豆籽粒(包括种子)中大豆疫霉病菌的检疫检测与鉴定。
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括的修改单)适用于本文件。
3原理 大豆疫霉病菌（Phytophthora sojaeKaufmann&Gerdemann）属藻菌界（Chromista），卵菌门（Oo- 豆荚及籽粒，但以引起大豆根腐病和茎腐病较为普遍。
常规检测中，可根据分离培养中病原菌的菌丝、 孢子囊及卵孢子形态特征进行鉴定；PCR检测中，利用特异引物对病菌DNA扩增时获得的特异DNA 片段进行鉴定。
4试剂与材料 传统分离培养所用基础培养基及选择性培养基，参见附录A；叶碟诱捕所用试剂，参见附录B;PCR 所用试剂配制及用途，参见附录C。
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂。
实验用水应符合GB/T6682一2008中一级水的 规格。
5仪器与用具 解剖刀、培养Ⅲ、高压灭菌锅、烘箱、培养箱天平（感量1/100；1/10000)、研钵、粉碎机、数显摇床、水 浴锅、制冰机、纯水器、旋涡震荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、PCR仪、真空抽干 镜和镜台测微尺或测量软件）、烧杯、载玻片、盖玻片、电泳设备、紫外凝胶成像仪、微量进样器。
6现场检测 6.1植株症状诊断 在大豆生长期进行田间症状目测踏查，重点调查田边地头及地势低洼积水处。
根据大豆疫霉病典 型症状(参见附录D)进行诊断。
对于田间不能确定的，采集疑似症状的植株样本进行室内检验鉴定，必 要时采集疑似发病植株根际周围深0cm～10cm土壤100g进行室内检验。
6.2豆粒检验 检查并收集大豆种子或原粮中不饱满、青的豆粒，夹带的病残体及夹杂的土壤样品，带回实验室检测。
7室内检测 7.1新鲜植株检测
NY/T 2114-2012 7.1.1分离鉴定 用灭菌解剖刀切取0.5cm²大小的病健交界处组织置于选择性培养基表面，需注意培养基表面的水分 一定要事先吹干，于25℃培养箱中培养2d～3d，根据培养基上菌落形态、菌丝颜色，在低倍镜下观察菌 丝形态特征（参见附录E)，即可判断是否为大豆疫霉病菌。
无法判断的，可参照7.1.2进行PCR检测。
7.1.2PCR检测 取一段新发病的植株组织，在研钵中充分研磨后，转移磨碎后的发病组织2mg～3mg至1.5mL的 液加人495μL浓度为0.1mmol/L.Tris缓冲液（pH=8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应，PCR扩 增程序均见附录F。
此方法也适用于提取长在培养基上的新鲜菌丝的DNA。
7.2病残体的检测 病残体可用PCR法进行检测。
首先进行病残体中病原菌DNA模板的提取：将实验用的器Ⅲ清洗 干净，并灭菌；挑选出可疑的病残体，用粉碎机将样品打碎成粉末，称取100mg，加液氮充分研磨，迅速 清液，加入RNase酶解（终浓度为10mg/L)，37C保温30min后，加人等体积的酚：氯仿：异戊醇= 25：24：1，混匀，13200g离心15min；吸取上清液，再次加人等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，13200 g离心15min；再取上清液，加入等体积的异丙醇，充分混匀，4C的冰箱中静置30min以上；13200g离 心10min。
弃去上清液，留沉淀，加70%的乙醇，洗涤3次，干燥后加人100uL去离子水。
然后进行 PCR扩增检测，扩增程序见附录F。
7.3土壤样品检测 7.3.1PCR检测方法 首先进行土壤样品中病原菌DNA模板的提取，方法见附录G，然后进行PCR扩增检测，PCR扩增 程序见...
