附件3 鸡新城疫活疫苗中非法添加/改变制苗 用毒种检测方法 1.适用范围 1.1本方法适用于鸡新城疫活疫苗中非法添加/改变制苗用 毒种的检测. 1.2非法添加/改变制苗用毒种的检测范围为基因Ⅶ型新城 疫病毒核酸. 1.3检测对象为鸡新城疫活疫苗La Sota株、Clone30株、F株、 HB1株、N79株、CS2株、V4/HB92株、ZM10株、VG/GA株等疫 苗株. 2.试验材料 2.1引物 针对鸡新城疫病毒(Newcastle Disease Virus NDV)F基因保守 区域设计一对通用型引物. NDV-F(Universas型)-F:5’-ACAGGRTCAATCATAGT-3' NDV-F(Universas型)-R:5’-CAGTAWGAGGTGTCAAG-3' 针对基因Ⅶ型新城疫病毒F基因差异序列，设计一对基因Ⅶ 型特异性引物. 13 NDV-F(I型)-F:5’-AGTTTAATAATACGGCGCGA-3’ NDV-F(I型)-R:5’-GCAATAACTGAGCCYYTAAG-3’ 2.2阳性对照和阴性对照 阳性对照： 鸡新城疫病毒La Sota株，毒种编号为CVCC AV1615 来源于 国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心. 基因I型新城疫病毒核酸标准品，编号为CVCC Z333 来源于 国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心. 阴性对照：生理盐水或无菌水. 2.3试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂、琼脂糖、50xTAE、DNA marker、无核酸酶水、生理盐水. 3.检测方法 3.1样品稀释 取疫苗按瓶签标示，用生理盐水稀释至每毫升至少含100羽 份；阳性对照按瓶签标示原倍或10倍稀释后使用. 3.2RNA提取 将稀释后的疫苗和阴、阳性对照按商品化核酸提取试剂盒进 行RNA核酸提取. 3.3RT-PCR反应 将3.2步骤提取的RNA进行一步法RT-PCR反应，一步法RT -14- -PCR反应程序如下：50°C30min 92°C2min、94°C30s、55°C30s、 72C1min 共30个循环，最后72C延伸10min.一步法RT-PCR 反应体系见表1： 表1一步法RT-PCR反应体系(25μL) 试剂 体积(uL) PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 2x1 Step Buffer Dye Plus) 12.5 上游Primer(10uM) 1 下游Primer(10uM) 1 RNA模板 1 RNase-Free ddH20 8.5 3.4电泳 配置1%琼脂糖凝胶，取10lRT-PCR产物进行电泳， 120V 30min. 4.结果判定 4.1试验成立条件，新城疫病毒(La Sota株)通用型引物应扩 增出大小约为842bp条带，基因Ⅶ型新城疫病毒特异性引物应无 条带；基因Ⅲ型新城疫病毒核酸标准品通用型引物应扩增出大小 约为842bp条带，基因Ⅶ型新城疫病毒特异性引物应扩增出大小 约为609bp特异性条带；阴性对照均无条带，则试验成立. 4.2样品用新城疫病毒通用型引物应扩增出大小约为842bp 条带.若用基因Ⅶ型新城疫病毒特异性引物扩增出大小约为 609bp条带，则判定样品中检出基因Ⅶ型新城疫病毒核酸. 15 ...
农业农村部公告第717号-3-2023 鸡新城疫活疫苗中非法添加改变制苗用毒种检测方法.pdf
