CCSB16 ICS 65.020.20 中华人民共和国国家标准 GB/T43160-2023 梨火疫病菌检疫鉴定方法 Detection and identification ofErwinia amylovora 2023-09-07发布 2024-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会
GB/T43160-2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。
关、广州海关技术中心、乌鲁木齐海关技术中心、天津市滨海新区农业服务中心、昌吉市农业技术推广中 心、伊宁海关技术中心、南京农业大学。
本文件主要起草人：赵文军、田茜、张王斌、马云龙、易建平、魏霜、王、张小菊、李乐书、王朝阳、 孟茹、陆平、胡白石。
GB/T 43160-2023 梨火疫病菌检疫鉴定方法 1范围 本文件描述了梨火疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测方法。
本文件适用于梨、草果等蔷薇科植物植株、砧木、接穗及幼果传带的梨火疫病菌的检疫鉴定以及病 害的田间调查与监测。
2规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。
3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。
4梨火疫病菌基本信息 学名：Erwiniaamylovora（Burrill,1883）Winslowetal.,1920 传播途径：染病的植物繁殖材料(包括种苗、砧木和接穗）、昆虫、风、雨以及被污染的包装材料和运 输工具等多种自然因素及人为因素均可引起梨火疫病的传播。
其中，染病的植物繁殖材料是梨火疫病 远距离传播的主要途径。
梨火疫病菌的其他信息参见附录A。
5方法原理 根据梨火疫病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据梨火疫病菌的特异性DNA序列 进行分子生物学检测；根据梨火疫病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行 分离培养鉴定及致病性测定。
6仪器设备和主要试剂 6.1仪器设备及用具 超净工作台、恒温培养箱、摇床、超低温冰箱、常规冰箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、小型离心机、高速 离心机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、Biolog微孔板、全自动微生物 鉴定仪（Biolog）、制冰机、电子天平、涡旋振荡器、微量进样器等。
6.2主要试剂 2XPCR反应预混液、2X荧光PCR反应预混液等，缓冲液及培养基按附录B配制，除另有规定 外，试剂均为分析纯。
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GB/T 43160-2023 7检疫鉴定方法 7.1症状检查 检查植株有无梨火疫病的典型症状见附录A中的症状描述，早春为重点监测时期。
主要检查嫩 梢、花、果和枝干等部位，观察嫩梢是否出现萎(牧羊鞭状)、变黑枯死；花和幼果是否变黑枯死；叶脉是 否从叶柄基部向上变黑；枝干是否有溃疡斑以及病组织上是否有菌脓。
对出现典型症状或疑似症状的 植株进行拍照记录，并采集表现症状的嫩梢、花、枝干、幼果等送实验室检测鉴定。
对于未表现典型症 状的幼嫩枝条，应重点对其顶端和基部取样。
7.2样品的制备 7.2.1显症植株样品的制备 样品采集后应尽快检测，若不能及时检测，样本应在4℃C～8℃下保存，尽可能不超过一周。
采集 样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染。
样品处理应采用分离培养、免疫学和分子生物学检测都有效的通用程序。
样品用无菌蒸馏水或 pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)处理，直接用于分离培养、免疫学或分子生物学检测。
尽量选择表现出最典型症状并带有菌脓的植物部位(花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实)。
挑取病健交 界部位的植物组织，切成约0.1g～1.0g的小块，放人装有适量PBS或无菌蒸馏水的离心管或培养皿中 研磨或挤压，静置至少5min，制成样品悬浮液，用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。
7.2.2无症植株样品的制备 无症状样品宜单个处理，或者最多10个一组。
样品处理和提取过程中小心避免交叉污染。
开花期开始至果实膨大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，装人无菌袋或容器中。
从待检植株上剪下 长度约为20cm的嫩梢或花期时的花器。
如果在冬天进行采样检测，从每株植物上采集5个～10个花 蕾。
在实验室内，从挑选的植株上剪下花期时的花器、花梗和嫩梢下部几个叶片的叶柄基部或茎段。
称 取0.1g～1.0g植物材料，浸溃在7.2.1描述的无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液中，制成样品悬浮液。
处理由多个植物材料组成的样品时，可将其放人装有适量PBS或无...
