ICS07.080 A21 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T38568-2020 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 Determination of growth phenotype for industrialmicrobial strain- Microdroplet turbidity 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布 GB/T38568—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由中国标准化研究院提出并归口. 本标准起草单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所、中国标准化研究院. 本标准主要起草人：马波、葛安乐、王喜先、籍月彤、徐健、马爱进. SAC GB/T38568-2020 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 1范围 本标准规定了用微液滴浊度法测定工业微生物菌株生长表型的方法. 本标准适用于工业发酵用细菌、真菌和微藻菌株生长表型测定. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3.1 参考菌株reference strain 发酵性能明确，用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株. 4原理 通过微流控芯片产生单细胞包裹液滴，并培养，根据液滴中的菌体面积，进行生长速率的计算. 5试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯. 5.1水 符合GB/T6682规定的二级水. 5.2基础培养基 按GB/T14926.43给出的方法配制.或选用商品化的预制培养基，严格按照商品说明书加水 配制. 5.3PBS缓冲液，pH7.4 称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g、磷酸氢二钠(Na:HPO)1.42g、氯化钠(NaC1)8g、氯化钾 (KC1)0.2g 将上述各成分加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定 1 GB/T38568—2020 容到1L. 5.4超低融点琼脂糖 凝胶点为8℃~17℃. 5.5氟碳油. 含有表面活性剂. 6仪器设备 6.1恒温箱：士1℃. 6.2离心机：500g~4000g. 6.3倒置显微镜：带成像模块. 6.4聚四氟乙烯导管：内径0.5mm. 6.5PDMS微流控芯片：高度为100μm 后面连接有至少50个培养腔室结构，每个腔室尺寸为1.5mm ×1mm.油相两侧线性结构相同，每一侧长为29.2mm 宽度为40m;水相的线性结构长为 4.54mm 宽度为60m. 6.6分光光度计. 6.7热板. 7测定步骤 7.1菌株活化 7.1.1按GB/T14926.43给出的方法配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基，用无菌接种环分 别蘸取参考菌株和待评价菌株保种菌液，在固体平板上划线，根据生产工艺参数选择相应的温度和 PH值，进行培养，直至长出单菌落：分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落，接种至含有5mL 液体培养基的试管中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至对数期. 7.1.2从活化的平板培养皿挑取微生物菌株单克隆于5L液体培养基的容器中，根据生产工艺参数 选择相应的温度和转速，培养至稳定期，去除上清后加人PBS溶液，重复清洗3次. 7.2微生物菌液浓度选取 用基础培养基稀释得到细胞悬液浓度约为6X105CFU/mL. 7.3琼脂糖溶液制备 用分析天平称取0.02g超低熔点琼脂糖置于无菌EP管中，并向其中加入1mL已灭菌的基础培养 基，加热溶解，配制成2%（质量浓度）的溶液.趁热用0.22μm的无菌滤头过滤，现用现配. 7.4单细胞液滴发生 7.4.1各取500μL微生物菌液和琼脂糖溶液等体积混匀. 7.4.2取一块芯片，分别在芯片的油相人口加入200L氟碳油和水相入口加人100L低熔点琼脂糖 菌液，将注射器与芯片出口相连. 7.4.3将芯片放在热板上（温度稳定性士1℃，范围在30℃~37℃），将注射器的活塞固定在2L刻 2 GB/T385682020 度处，通过注射器内的负压使液体进入芯片，开始发生液滴.液滴发生需要2min左右. 7.4.4取另一块芯片重复上述步骤，一为待鉴定菌株，另一为参考菌株.此步骤重复三次. 7.5单细胞液滴培养 液滴发生结束后，移除芯片上的枪头和聚四氟乙烯管，将两芯片放入4℃冰箱凝固20min后再置 人盛有水的培养皿中于37℃恒温箱进行培养6h. 7.6芯片成像 将芯片置于倒置显微镜，在10×物镜下进行成像，获取至少20个图...
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