ICS07.080 A21 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T38569-2020 工业微生物菌株质量评价 、拉曼光谱法 Performance evaluation of industrial microorganism strain- Raman spectroscopy 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布 GB/T38569—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由中国标准化研究院提出并归口. 本标准起草单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所、中国标准化研究院. 本标准主要起草人：马波、籍月彤、何日辉、李洵融、徐健、马爱进. GB/T38569—2020 工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法 1范围 本标准规定了用拉曼光谱法评价工业微生物菌株质量的方法. 本标准适用于工业发酵用细菌、真菌、微藻等相对于参考菌株的质量一致性评价. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3.1 工业微生物菌株质量评价performance evaluation of industrial microorganism strain 利用拉曼光谱法开展工业微生物菌株质量一致性评价. 3.2 参考菌株reference strain 发酵性能明确，用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株. 4原理 细胞内部化合物拉曼光谱的叠加信息可以反映该细胞的综合表型，通过比较待评价菌株与参考菌 株单细胞拉曼光谱的相似性，可以判断待评价菌株是否具有与参考菌株可比较的发酵性能. 5试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的二级水. 5.1无菌培养基 按照菌种类型配制，或选用相应商品化培养基. 5.2载玻片 氟化钙载玻片(25mmX75mm). 6仪器设备 试验中所使用的仪器设备为： GB/T38569—2020 a)显微拉曼光谱仪：光谱分辨率不低于5cm-1 拉曼位移波数范围至少包含400cm-1~ 1850cm-1; b)培养箱； c)摇床； d)离心机. 7测定步骤 7.1菌株活化 根据生产工艺配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基，用无菌接种环分别蘸取参考菌株和 待评价菌株的保种菌液，在固体平板上划线，根据生产工艺参数选择相应的温度等条件进行培养，直至 长出单菌落；分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落，接种至含有5mL液体培养基的试管 中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至对数期. 7.2菌株培养 用微量移液器分别移取活化后的参考菌株和待评价菌株各200μL 分别接种至3个含有20ML液 体培养基的容器中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至稳定期. 7.3样品前处理 7.3.1分别移取培养后的参考菌株和待评价菌株各1mL至无菌管中. 7.3.2选择相应的转速离心，弃掉上清，加入1mL无菌双蒸水，混匀菌体. 7.3.3按照7.3.2重复2次，移取10L菌液，至无菌管中，加入990L无菌双蒸水，混匀，移取2L稀 释后的菌液，在洁净的氟化钙载玻片上点样，无菌环境下室温风干. 7.4测量 7.4.1将风干后的氟化钙载玻片置于显微拉曼光谱仪载物台上，在透射式明场模式下选择单个细胞， 切换至光谱采集模式，测定拉曼光谱信号. 7.4.2每个样本随机选取至少20个单细胞作为样品信号. 7.4.3在点样区内，采集3个无细胞处信号，并计算平均值，作为背景信号. 7.5数据处理 7.5.1对单细胞拉曼光谱原始数据进行背景信号扣除（样品信号减去背景信号）、基线校正(>5阶函 数)和基于面积的归一化处理. 7.5.2计算信噪比，其中信号采用1001cm-1处的尖锐拉曼峰对应的信号强度，舍弃信噪比小于3的 数据，补充数据个数，使得待评价菌株组和参考菌株组具有相同的数据个数. 8结果计算和分析 8.1结果计算 8.1.1余弦距离按式(1)计算： 2 GB/T38569—2020 2(ax6) cose(a b)= (1) 式中： 一单细胞a与单细胞b的拉曼光谱向量的夹角； cosf(a b)一单细胞a与单细胞b的拉曼光谱余弦距离； a: —一单细胞a拉曼位移i对应的强度； be 一单细胞b拉曼位移对应的强度. 计算余弦距离的平均值和标准偏差，并以细胞数为横坐标，以变异系数为纵坐标作图，若曲线达到 平台，说明细胞数已足够，若曲线未达到平台，则增加单细胞拉曼光谱采集个数，直至饱和为止. 8.1.2相似度按式...
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