ICS65.120 B40/49 HS 中华人民共和国海关行业标准 HS/T13—2006 牛、羊、鹿源性成分鉴定方法 实时荧光PCR方法 Identification of bovine sheep goat and deer-derived materials Real-time fluorescence PCR method 2007-03-28发布 2007-04-01实施 中华人民共和国海关总署发布 55 HS/T13—2006 前言 本标准的附录A为资料性附录. 本标准由中华人民共和国海关总署关税征管司提出. 本标准由中华人民共和国海关总署政策法规司归口. 本标准起草单位：中华人民共和国大连海关. 本标准主要起草人：尹兵、李大志、孙利. 56 HS/T13—2006 牛、羊、鹿源性成分鉴定方法实时荧光PCR方法 1范围 本标准规定了牛、羊、鹿（指牛、羊和鹿种属）源性成分产品使用实时荧光PCR定性分析方法的 DNA的提取、实时荧光PCR方法. 本标准适用于进出口含牛、羊、鹿源性成分产品的SYBR Green I实时荧光PCR定性分析. 2总则 按照本方法规定提取样品的DNA 应用实时荧光PCR技术针对特异性牛、羊、鹿动物源性成分基 因片段进行扩增，对目的基因进行扩增，反应体系中加人SYBR Green I嵌合荧光染料，通过检测目 的基因是否有荧光信号的增幅来判断样品中是否存在牛、羊、鹿动物源性成分，并通过测定扩增产物 的DNA融解温度判断反刍动物源性成分的种类. 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本标准： 3.1.1 牛、羊、鹿源性成分bovine sheep goat and deer-derived materials 牛、羊、鹿种属特异性DNA片段. 3.1.2 实时荧光PCR Real-Time Fluorescence PCR 通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程. 3.2缩略语 下列缩略语适用于本标准： BSA牛血清白蛋白(bovine serum albumin) ddH2O双蒸水(double distilled water) DNTP脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) EDTA乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) GuSCN异硫氰酸胍(guanidinium isothiocyanate) PCR聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) Taq水生栖热菌(Thermus aquaticu) TE Tris-Cl、EDTA缓冲液 Tris三（羟甲基）氨基甲烷(tri-hydroxymethyl aminomethane.) Triton X-100辛基苯氧基聚乙氧乙醇 4试剂和仪器 4.1试剂和材料 本标准使用下列试剂和材料： a)牛、羊、鹿动物源性成分检测用引物（对）序列为： 正向引物：5'-GAT GCT CCG TTT GCG TGT A-3' 反向引物：5'-ACA GGC CTA TTC CTA GCA AT-3' 57 HS/T132006 b)氯仿 c)异丙醇 d)70%乙醇 e)裂解液：5mol/L GuSCN;0.05mol/L Tris-HCl pH6.4;0.02mol/L EDTA pH8.0; 1.3%Triton X-100. f)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl pH8.0;1mmol/L EDTA pH8.0. g)ddH2O h)Tag DNA聚合酶 i)dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP j)10XPCR缓冲液：100mmol/LKCl 160mmol/L(NH)2SO4 20mmol/L MgSO4 200mmol/L Tris-HCl(pH8.8) 1%Triton X-100 1mg/mL.BSA. k)SYBR Green I嵌合荧光染料 除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌去离子水. 安全提示：本标准使用的氯仿和异丙醇为有害和易挥发试剂，使用者应当在无明火、通风良好的 环境中进行操作. 4.2仪器和设备 本标准使用下列仪器和设备： a)离心机； b)pH计； c)移液器：10uL、20gL、100gL、1000gL; d)实时荧光PCR仪. 5测定步骤 5.1模板DNA提取 称取50mg经粉碎的试样于1.5mL离心管中，加入200uLTE 混匀；加入400uL裂解液，加 400L氯仿，混匀；10000rpm离心5min 取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10000rpm离 心5min 弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50LT...
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