ICS65.020.30 CCS B41 TCAOE 中国海洋工程咨询协会团体标准 T/CA0E74—2024 海洋贝类片形科吸虫PCR检测方法 PCR methode for the detection of Prosostomata trematode in marine mollusk 2024-02-04发布 2024-02-04实施 中国海洋工程咨询协会 发布 T/CA0E74—2024 目次 前言 II 1范围.... 2规范性引用文件1 3术语和定义1 4缩略语. 1 5试剂............ 1 6仪器与设备 2 7样品...... 2 8检测方法和阳性结果确认 3 9结果判断及表述 3 10安全 .. . 3 11防污染措施 3 12附录. 4 I T/CA0E74—2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草. 本文件由鲁东大学提出. 本文件由中国海洋工程咨询协会归口. 本文件起草单位：鲁东大学、中国水产科学研究院长岛增殖实验站. 本文件主要起草人：王晓通、刘雅琼、魏磊、蔡忠强、王晓娜、房燕、李明珠. II T/CA0E74—2024 海洋贝类片形科吸虫PCR检测方法 1范围 本文件规定了海洋贝类片形科吸虫的普通PCR检测方法，包括试剂、仪器与设备、样品、检测方 法和阳性结果确认、结果判断及表述等内容. 本文件适用于海洋贝类中寄生的片形科吸虫的检测，包括肝片吸虫(Fasciola hepatica)和大片吸虫 (F.gigantica)等. 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489-2008实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因分析检测实验室技术要求 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. 4缩略语 下列缩略语适用于本文件. 4.1TAE:Tris、乙酸(Acetic acid)和EDTA组成的缓冲液 4.2ITS:内部间隔序列(Internal transcribed spacer) 4.3EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid) 4.4SDS:十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate) 4.5TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTA Tris-HC) 4.6EB:溴化乙锭(Ethidium bromide) 4.7PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) 4.8Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris hydroxymethyl aminomethane.) 5试剂 5.1水：符合GB/T6682中规定的一级水. 5.250XTAE电泳缓冲液：按附录A.1配制. 5.3异丙醇：分析纯. 5.4氯仿/异戊醇混合液(24：1)：分析纯. 5.5酚/氯仿/异戊醇混合液(25：24：1)：分析纯. 5.6无水乙醇：分析纯. 5.770%乙醇：按附录A.2配制. 5.8检测引物ITS-F(10Hmol/L):5-TGTCCGAGGGTCGGCTTATAAAC-3' -20C保存. 5.9检测引物ITS-R(10HMol/L):5'-CACGAGGGTGCCGTCGTTATAT-3 -20C保存.扩增片形科 吸虫中380bp片段. 1 T/CA0E74—2024 5.10DNA分子质量标准溶液：生化试剂. 5.1110×上样缓冲液：按附录A.3配制，或其它等效产品. 5.12PCR检测阳性对照为已知受片形科吸虫感染的贝类组织样品或添加片形科吸虫保守序列标准品 质粒的贝类组织样品，PCR检测结果为阳性，-80C保存. 5.13PCR检测阴性对照为已知未受片形科吸虫感染的贝类组织样品，-80℃保存. 5.14EB(10μg/L):按附录A.4配制，或其它等效产品. 5.1510%SDS:按附录A.5配制. 5.16TE缓冲液：按附录A.6配制. 5.17裂解缓冲液：按附录A.7配制. 5.18蛋白酶K:生化试剂. 5.19饱和酚：生化试剂. 5.20 琼脂糖：生化试剂. 5.213mol/L NaAc(pH5.0):按附录A.8配制，或其它等效产品. 5.222 XPremix Tag DNA聚合酶：生化试剂，-20C保存. 6仪器与设备 PCR仪、凝胶成像系统、恒温...
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