ICS65.020.30 CCS B 41 TCAOE 中国海洋工程咨询协会团体标准 T/CA0E75—2024 牡蛎徐氏拟裸茎吸虫荧光定量PCR检测方 法 Fluorescence quantitative PCR method for the detection of Gymnophalloides seoi Lee in oyster 2024-02-04发布 2024-02-04实施 中国海洋工程咨询协会 发布 T/CA0E75—2024 目次 前言 II 1范围..... ..1 2规范性引用文件1 4缩略语......... 1 5试剂........... 1 6仪器与设备 2 7样品.... 2 8样品核酸质量检测 . . 3 9实时荧光PCR检测方法和条件. 3 4 10结果判定 11安全..... 4 12防污染措施...... 4 13附录.. 5 I T/CA0E75—2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草. 本文件由鲁东大学提出. 本文件由中国海洋工程咨询协会归口. 本文件起草单位：鲁东大学、中国水产科学研究院长岛增殖实验站. 本文件主要起草人：王晓通、刘雅琼、魏磊、蔡忠强、王晓娜、房燕、李明珠. II T/CA0E75—2024 牡蛎徐氏拟裸茎吸虫荧光定量PCR检测方法 1范围 本文件规定了太平洋牡蛎中寄生徐氏拟裸茎吸虫(Gymnophalloides seoi Lee)的实时荧光定量聚合 酶链式反应（以下简称实时荧光PCR)检测方法，给出了实时荧光PCR法所需的试剂、仪器与设备、 样品、检测方法和条件、结果处理及结果判定等内容. 本文件适用于牡蛎科寄生徐氏拟裸茎吸虫的检测. 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因分析检测实验室技术要求 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. 4缩略语 4.1COI:细胞色素c氧化酶第一亚基(Cytochrome c oxidase subunit I) 4.2DEPC:焦炭酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate) 4.3Ct值：循环阈值(Cycle threshold) 4.4 RNase:核糖核酸酶(Ribonuclease) 4.5EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid.) 4.6PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) 4.7TAE:Tris、乙酸(Acetic acid)和EDTA组成的缓冲液 4.8EB:溴化乙锭(Ethidium bromide) 5试剂 5.1水：符合GB/T6682中规定的一级水. 5.250×TAE电泳缓冲液：按附录A.1.1配制. 5.310×上样缓冲液：按附录A.1.2配制，或其它等效产品. 5.4 TRIzol:生化试剂. 5.5异丙醇：生化试剂. 5.6氯仿：生化试剂. 5.7EB(10μg/uL):按附录A.1.3配制，或其它等效产品. 5.8无RNase去离子水：按A.2.2配制，或其它等效产品. 5.975%乙醇：按附录A.2.3配制. 5.10实时荧光PCR反应试剂SYBR Green Premix Ex TagⅡI预混液：商品化试剂，包括Tag DNA聚合 酶(5U/uL)、PCR反应缓冲液、MgCl2(3mmol/L~7mmol/L)、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、 1 T/CA0E75—2024 SYBR荧光染料等. 5.11反转录PCR反应试剂：商品化试剂，包括反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix I、反转录反应缓 冲液5 X PrimeScript Buffer、Oligo dT Primer(50uM)、Random6mers(100uM)、RNase Free dH2O. 5.12引物COI-QF:GGTTGATGTTAAGACTTCGG -20C保存. 5.13引物COI-QR:CACTACCGTGATACTTAGAAC -20C保存. 5.14阳性对照为已知受徐氏拟裸茎吸虫感染的牡蛎组织样品，-80℃保存. 5.15阴性对照为已知未受徐氏拟裸茎吸虫吸虫感染的牡蛎组织样品，-80℃保存. 5.16DNA分子...
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