10S11.080.99 CCS C 178 T/NAIA 团 体标准 T/NAIA0289—2024 一次性使用卫生用品中绿脓杆菌检验 实时荧光PCR法 Determination of Pseudomonas aeruginosa in disposable sanitary products- Real time PCR method 2024-05-17发布 2024-05-30实施 宁夏化学分析测试协会发布 T/NAIA0289-2024 目次 前言 II 1范围.... ..1 2规范性引用文件...... ..1 3术语和定义. 4原理.1 5试剂和材料.1 6仪器和设备....... 2 7实验操作步骤.. 2 8结果分析及表述... 3 9预防污染措施........ 4 附录A 5 附录B 6 I T/NAIA0289-2024 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草. 本文件由宁夏计量质量检验检测研究院提出. 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口. 本文件起草单位：宁夏计量质量检验检测研究院、宁夏食品检测研究院、宁夏大学. 本文件主要起草人魏嘉雯、姚博伟、简敏捷、邢雅琴、吕晓东、姜晨、张文轩、田菊梅、冯秀娟、 张惠玲、潘琳. 本文件为首次发布. II T/NAIA0289-2024 一次性使用卫生用品中绿脓杆菌检验实时荧光PCR法 1范围 本文件规定了一次性使用卫生用品中绿脓杆菌的实时荧光PCR检测方法. 本文件适用于一次性使用卫生用品中绿脓杆菌的定性检测. 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件. GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法 GB15979一次性使用卫生用品卫生标准 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3.1一次性一次性使用卫生用品 使用一次后即丢弃的、与人体直接或间接接触的、并为达到人体生理卫生或卫生保健（抗菌或抑菌） 目的而使用的各种日常生活用品，产品形状可以是固体或液体.例如，一次性使用手套或指套（不包括 医用手套或指套)、纸巾、湿巾、卫生湿巾、电话膜、帽子、口罩、妇女经期卫生用品（包括卫生护 垫)、尿布等排泄物卫生用品（不包括厕所用纸）等. 3.2DNA(deoxyribon uleic acid):脱氧核糖核酸 3.3eta(exotoxin A gene):胞外毒素编码基因 3.4PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应 3.5Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阙值时所经历的循环数 4原理 一次性使用卫生用品样品经扩增培养后，提取增菌液中DNA 以提取的DNA为模板，以绿脓杆菌 中(eta)基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光PCR扩增，根据Ct值判断样品 中是否含有绿脓杆菌. 5试剂和材料 试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403的规定执行. 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.试剂均用无DNA 酶污染的容器分装. 1 T/NAIA0289-2024 5.1试剂 5.1.1 SCDLP液体培养基：见附录A.1. 5.1.2PCR扩增引物序列：见附录B.1. 5.1.3荧光探针序列见附录B.1. 5.1.42X荧光定量PCR预混液. 5.1.5商品化DNA抽提试剂盒. 5.1.6绿脓杆菌标准菌株：来源自国家认可的菌种保藏机构. 5.2耗材 5.2.1离心管：200uL、1.5mL、5mL、10mLa 5.2.2PCR反应管：单管、八联管或96孔PCR微孔板. 6仪器和设备 6.1分析天平：感量0.01g. 6.2微量可调移液器：单道：1~10uL、10~100L、100~1000L. 6.3恒温水浴锅. 6.4涡旋仪. 6.5冷冻高速离心机. 6.6高压灭菌锅. 6.7超净工作台. 6.8二级生物安全柜. 6.9实时荧光定量PCR仪. 6.10恒温培养箱：35士1℃. 6.11核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计. 6.12冰箱：4℃，-20℃. 7实验操作步骤 7.1取样 在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取101g 样品.剪碎后加入200L无菌生理盐水中，充分混匀.液体产品直接用原液作为样液. 7.2增菌 取样液(7.1)5mL 加入到50 mL SCDL...
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