ICs11.220 B41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T17494—2009 代替GB/T174941998 马传染性贫血病间接ELISA诊断技术 Diagnostic techniques of indirect ELISA technique for equine infectious anemia disease 2009-04-23发布 2009-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T17494-2009 前言 本标准参照世界动物卫生组织(0IE)最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2004年版，并结 合我国现有动物卫生法规及农业部对马传贫的相关政策和措施修订，其技术内容与正所推荐的基本 一致. 本标准代替GB/T17494一1998《马传染性贫血病间接ELISA技术规程》. 本标准与GB/T17494一1998相比主要变化如下： ——“前言”部分作适当变动； —删除第2章的内容； 一第4章“仪器设备”和第5章“试剂”部分改为“材料准备”，并对内容作较大的改动； —第6章“配制溶液”部分放置在附录内； ——修订原标准中的语句和计量单位等错误用法. 本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录. 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口. 本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草， 本标准主要起草人：相文华、郭巍、赵立平、戴玉坤. 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T17494-1998. I GB/T17494-2009 马传染性贫血病间接ELISA诊断技术 1范围 本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA诊断技术的测定原理、材料准备、操作方法和结果判 定等. 本标准适用于检测马血清中的马传贫病毒抗体.可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马 匹的检疫、马传贫病马的定性，也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定. 2测定原理 用制备的马传贫病毒抗原，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行.当被检血清中 有马传贫病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原抗体复合物，再与酶标记的抗体（抗马免疫球蛋 白)反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行马传贫病毒抗体的定性、定量测定. 3材料准备 3.1器材 3.1.196孔平底微量反应板. 3.1.2微量移液器. 3.1.3酶标测定仪. 3.1.4恒温箱. 3.1.5保湿盒等. 3.2试剂 3.2.1兔抗马IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）为冻于品，见附录A. 3.2.2马传贫病毒抗原包被板见附录B. 3.2.3马传贫病毒标准阳性血清和标准阴性血清均为冻干品. 3.2.4磷酸盐缓冲液(0.02mol/L pH7.2 PBS)配制方法见第C.1章. 3.2.5洗涤缓冲液(0.02mol/L pH7.2 PBS-0.05%吐温-20)的配制方法见第C.2章. 3.2.6血清及酶标记抗体稀释液(0.02mol/L PH7.2 PBS-0.05%吐温-20-0.1%白明胶-10%健康牛 血清)的配制方法见第C.3章. 3.2.7底物缓冲液(H5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，内含0.04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)的配制 方法见第C.4章. 3.2.8终止液(2mol/L 碗酸)的配制方法见第C.5章. 4操作方法 4.1冲洗包被板：向各孔注入洗涤缓冲液，浸泡3min 甩千，再注人洗涤缓冲液，重复3次.甩干孔内 残液，在滤纸上吸干. 4.2加被检血清及对照血清：将每份被检血清样品各取50L加人到血清稀释板的各孔内，再将稀释 液0.95mL依次加入各孔内，作1：20倍稀释.混匀后分别取100μL依次加人抗原包被反应孔中，每 份血清加两个孔.每块反应板设阴性血清和阳性血清对照各两孔，每孔100μL.盖好包被板置37℃ 湿盒内1h 冲洗同4.1. 4.3加酶标记抗体：用酶标抗体稀释液将冻干酶标记抗体稀释至工作浓度，每孔加100μL 置37℃湿 1 GB/T17494-2009 盒内1h 冲洗同4.1. 4.4加底物缓冲液：每孔加新配制的底物溶液100L 在室温下避光反应5min~10min 见附录D. 4.5终止反应：每孔加终止液20μL~30L. 5结果判定 5.1目测法 阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判为马 传贫病毒抗体阳性.如遇颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异者，用目测法难以判定时，则以 比色法测定为最终结果. 5.2比色法 用酶标测试仪，在波长492nm下，测定各孔OD值，阳性对照血清两孔平均OD值大于1.0，阴性 对照血清两孔平均OD值小于等于...
GB/T 17494-2009 马传染性贫血病间接ELISA诊断技术.pdf
