ICS65.020.30 B43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25165-2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 Protocol of identification of bovine caprine ovine and porcine derived materials in gelatin-Real time PCR method 2010-09-26发布 2011-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25165—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口. 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院. 本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜. I GB/T25165—2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法. 本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测. 该方法的检出限为0.1%. 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB6783食品添加剂明胶 GB/T14699.1饲料采样 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准. 3.1 实时荧光PCR real time PCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程. 3.2 Ct值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数. 4原理 利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定.利用裂 解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行内参照基 因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、 羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实 现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析. 5检测用引物和探针 内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表1. GB/T25165-2010 表1检测用引物和探针 名称 序列 目的基因 内参照5端引物 5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3' 真核生物 内参照3端引物 5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3' 18 SrRNA基因 内参照探针 5'-(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-3' 牛5端引物 5'-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3' 牛3端引物 5-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3' 生长激素基因 牛探针 5'-(FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3' 羊5端引物 5'-ACACAACTTCTACCACAACCC-3' 线粒体细胞色 羊3端引物 5'-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3 素b基因 羊探针 5'-(FAM)-ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3' 猪5端引物 5'-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3' 猪3'婚引物 S'-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3' 蛋白基因 猪探针 5'-(FAMD-CACCGTCAAGCAGC-(NFQ)(MGB)-3' 6试剂 苯酚(Tris饱和酚，pH8.0)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70%乙醇. 除另有规定外，试剂均为分析纯.实验用水符合GB/T6682中二级水的要求. 7配制溶液 7.1裂解液 成分包括：2%（质量浓度）CTAB(cetyltrithylammonium bromide 十六烷基三甲基溴化铵)， 100mmol/LTris(tris hydroxymethyl aminomethane 三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/L NaCI 20mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸)，用HCi调至pH8.0. 7.2实时荧光PCR反应混合液 12.5uL反应体系包括：1U~2U(Unit 酶学单位)的Taq...
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