ICS67.060 B23 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1740-2009 大豆中异黄酮含量的测定 高效液相色谱法 Determination of isoflavones in soybean by HPLC 2009-04-23发布 2009-05-20实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T1740—2009 前言 本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口. 本标准起草单位：农业部作物品种资源监督检验测试中心、中国农业科学院作物科学研究所. 本标准主要起草人：李为喜、刘方、王述民、朱志华、刘三才. NY/T17.40—2009 大豆中异黄酮含量的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了利用高效液相色谱法对大豆中异黄酮化合物分离、检测的方法. 本标准适用于大豆籽粒中异黄酮（黄豆苷、黄豆黄素苷和染料木苷）含量的测定.单个异黄酮化合 物的最低检出限为20mg/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括堪误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准. GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T5497粮食、油料检验水分测定法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样中的异黄酮化合物经有机溶剂提取后，直接注入反相色谱柱，不同的异黄酮化合物在色谱柱上 先后流出，经紫外光谱检测后与标准样品对比，进行定性定量分析. 4试剂和溶液 本标准所用试剂在未注明其他要求时，均指符合相应国家标准的分析纯试剂.除非另有规定，仅使 用分析纯试剂.水，符合GB/T6682规定的一级水.本标准所述溶液如未指明溶剂，均为水溶液. 4.1甲醇：色谱纯. 4.2冰乙酸：色谱纯. 4.3甲醇溶液：80%(8020)，用甲醇（色谱纯）加水配制. 4.4甲醇溶液：50%(5050)，用甲醇（色谱纯）加水配制，过0.45μm微孔滤膜. 4.5氢氧化钠溶液：c(NaOH)=2mol/L 按GB/T601配制. 4.6标准品：黄豆苷(daidzin)、染料木苷(genistin)和黄豆黄素苷(glycitin) 含量均大于95%. 4.7标准贮备液的配制：称取5mg黄豆苷、5mg染料木苷、5mg黄豆黄素苷，精确至0.01mg:分别置 于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度.单个贮备标准溶液的浓度分别为：黄豆苷100μg/mL 染 料木苷100μg/mL 黄豆黄素苷100ug/mL. 4.8混合标准液配制：分别吸取单个贮备标准溶液1mL置于同一个100mL容量瓶中，加人50%的甲 醇溶液稀释至刻度. 4.9标准工作液配制：使用前，将混合标准溶液用50%甲醇溶液(4.4)稀释成所需浓度的标准工作液， 绘制标准曲线. 5仪器和设备 5.1分析实验室常用仪器设备. 5.2高效液相色谱仪，附带紫外或二极管阵列检测器. 1 NY/T1740—2009 5.3色谱柱：C18反相柱. 5.4分析天平：最小分度值为0.00001g. 5.5恒温水浴振荡器. 6分析步骤 6.1试样的制备 去除大豆籽粒样品中杂质，取50g样品置于样品磨中粉碎，至全部通过0.5mm孔径样品筛. 6.2试液的制备 称取试样2.0g~-2.5g(精确至0.0001g) 置于250mL具塞三角瓶中，加入80%甲醇溶液(4.3)40 mL 盖紧瓶塞，用铝箔将瓶口封上，将三角瓶置于(65士2)℃的恒温水浴振荡器中，在(180士10)r/min 的振荡频率下振摇2h. 取出三角瓶放置至室温，加人2mol/L氢氧化钠溶液(4.5)3mL 盖紧瓶塞，用铝箔将瓶口封上，置 于康氏振荡器上，室温下振摇10min后，取下三角瓶，加人1mL冰乙酸(4.2)并在涡旋混合器上混匀， 将全部试液转入50mL容量瓶中，用80%甲醇溶液(4.3)稀释至刻度. 使用定量滤纸过滤.量取2.5mL滤液置于10mL容量瓶中，加人4mL水，用甲醇(4.1)稀释至刻 度，摇匀，于3000r/min下离心5min 取上清液置于样品瓶中，待测定. 6.3测定 6.3.1色谱柱 Symmetry C1s反相柱，5um 3.9mm×150mm 或相当类型的色谱柱. 6.3.2流动相 流动相A:甲醇冰乙酸(982)； 流动相B:水十甲醇冰乙酸(88102). 6.3.3色谱分析 流速：0.8mL/min;柱温：室温；检测器：紫外检测器；检测波长：260nm;进样量：20g1.梯度洗脱 程序见表1. 表1梯度洗脱程序 阶段 时间(min) 流速(mL) 流动相A(%) 流动相B(%) 1 0.0 0.8 5.0 9...
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