ICS 65.020.30 B 43 中华人民共和国国家标准 GB/T 25887-2010 奶牛脊椎畸形综合征检测 PCR-RFLP法 Method ofPCR-RFLPfor detecting plexvertebral malformation in dairy cattle 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会
GB/T25887-2010 前言 本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录C为资料性附录. 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口. 本标准起草单位：华中农业大学. 本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、胡修忠、刘文举、宋利军.
GB/T25887-2010 奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法 1范围 本标准规定了奶牛脊椎畸形综合征的PCR-RFLP检测技术. 本标准适用于奶牛脊椎畸形综合征的检测与诊断. 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准. 3. 1 奶牛脊椎畸形综合征plexvertebralmalformationindairycattle;CVM 奶牛的一种常染色体隐性遗传病，主要表现为母牛流产、胎儿早期死亡、出生后不久死亡，患病牛 主要症状表现为：颈短、脊椎畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等. 3.2 SLC35A3基因SLC35A3 gene 定位于牛第3号染色体上，在基因序列数据库（GenBank)中的登录号为AY160683，全长14901bp， mRNA为981bp，由7个外显子和6个内含子组成，该基因编码核糖转运蛋白，与脊柱发育有关，是奶牛 脊椎畸形综合征的致病基因. 3.3 限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP 检测DNA用限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小.因此凡是可以引起酶切位点变 异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造成酶切位点间 的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生. 4原理 为苯丙氨酸，导致奶牛脊椎畸形综合征的发生.采用PCR-RFLP技术检测牛样本基因组DNA变异，即 采用PCR技术扩增SLC35A3基因片段，限制性内切酶消化PCR扩增产物，电泳检测酶切产物，对 SLC35A3基因进行分型，根据基因型判定奶牛是否携带脊椎畸形综合征的致病基因. 5扩增SLC35A3基因片段的引入酶切位点PCR引物 5'CCACTGGAAAAACATGCTGTGAGTA3' 5'GCTCTCCTCTGTAATCCCCA3' 预期扩增长度为225bp. 1
GB/T 25887-2010 6试剂和仪器 6.1主要试剂 水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水. TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液、RsaI限制内切酶及10X酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量 标记购自试剂公司. 醇（24：1）、3mol/L乙酸钠、固定液、脱色液、染色液、显影液、停显液等.具体配制方法参见附录A. 6.2主要仪器 冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水 浴锅、双蒸馏水器、微量移液器. 7检测步骤 7.1牛基因组DNA制备 采用常规的酚仿抽提法提取牛样本基因组DNA.4C冰箱中保存备用. 7.2PCR扩增及其产物检测 20 μLPCR反应体系：0.4μmol/L引物、0.2 mmol/LdNTP、待测DNA 85ng~100 ng、1UTaq DNA聚合酶、10XPCR缓冲液，加适量双蒸水.可根据需要调整反应体系. PCR反应条件：94C变性3min，35个循环（94C30s 65℃30s 72℃30s)，72C延伸10min， 4C保温2min~10min. 取2μLPCR产物，2%~3%琼脂糖凝胶电泳（3V/cm~5V/cm，电泳20min~30min)，溴化乙锭 (EB)染色后，在凝胶成像系统观察条带.PCR扩增结果示意图见附录B中的图B.1. 7.3酶切及其产物检测 取16μLPCR扩增产物，加人5U限制内切酶RsaI和2μL10X酶切缓冲液，加水至20uL，反应 条件参见产品说明书. 10%~12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(3V/cm~5V/cm，电泳3h~4h)，银染（染色方法参...
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