ICS 65.020.30 B40 中华人民共和国国家标准 GB/T24863-2010 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 Technicalregulation offarm animals cell culture andcryopreservation 2010-06-30发布 2011-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
GB/T24863-2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口. 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所. 本标准主要起草人：关伟军、马月辉、李向臣、李哈、目雷、赵倩君、宫雪莲.
GB/T 24863-2010 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 1范围 本标准规定了畜禽体细胞保存方法. 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽细胞体外培养与保存. 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勤误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准， 3. 1 体细胞体外培养invitre somaticcellculture 将体细胞在模拟体内生存环境的体外条件中进行培养，使细胞生长增殖，并保留其完整结构和功能 特性的方法. 3.2 原代细胞培养primarycellculture 将体细胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法. 3.3 细胞冷冻保存cellcryopreservation 将体外培养细胞与冻存液按一定比例混匀后，按设定的降温速率降温，使其于液氮中长期保存的 过程. 4工作区条件 工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成. 其中，缓冲间面积应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于1.5W/m².紫 外线灯管距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min～30min.无菌室无菌等级的最低标准应达 到方级. 5主要仪器、设备 超净工作台、冰箱、鼓风干燥箱、高压燕汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天平、CO培养箱、 超纯水装置和显微镜等. 6清洗与消毒 6.1玻璃器血清洗与消毒 6.1.1浸泡 所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡12h.
GB/T 24863-2010 6.1.2刷洗 选软毛毛刷，反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后，60C下烘干后备用. 6.1.3酸漫 酸浸时间为24h. 6.1.4冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用超纯水浸洗3次～5次，烘干包装. 6.1.5消毒 高压灭菌应以0.14MPe~0.16MPa的压力下持续15min~30min. 6.1.6初次玻璃器血使用 初次使用玻璃器Ⅲ需要先经过浸泡和洗剧再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，其余操作同 6.1.3.6 1.4和6.1.5等步骤. 6.2金属器皿清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同6.1. 6.3塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器Ⅲ清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡 12h，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30min，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干 后备用.高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min. 7试剂与培养液 7.1水 实验用水符合GB/T6682一级用水的要求. 7.2平衡盐溶液 生理盐水或磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）适用于细胞传代前漂洗细胞. 7.2.1PBS 称取4.00gNaCI、0.10gKC1、1.45gNaHPO12HO、0.10gKHPO，加超纯水定容至 500mL，调节pH至7.2，高压灭菌，密封后置于4C条件下贮存. 7.2.2生理盐水 称取4.50gNaCl，加人500mL超纯水，高压灭菌，密封后置于4C条件下贮存. 7.3血清 10%~15%的胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）适合于家畜和家禽细胞的培养. 7.4培养基 85%~90%的高糖最低限量必需培养基（minimumcssentialmedium，MEM），适用于家禽细胞的 培养；85%~90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（dulbeccos modified eagle medium，DMEM），适 用于家畜细胞的培养.用直径为0.22pm和0.45μm滤器过滤， 7....
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