ICS 67.120.30 B 50 T/HBIQA 河北省检验检疫学会团体标准 T/HBIQA 0003.4-2024 食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法 第4部分：秋刀鱼实时荧光PCR法 Detection of mon Histamine-rich fish derived ingredient in food Part 4:Cololabis saira Real-time PCRmethod 2024-08-15发布 2024-10-15实施 河北省检验检疫学会发布
T/HBIQA 0003.42024 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草.
T/HBIQA0003-2024《食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法实时荧光PCR法系列标准》分为7 个部分： 第1部分：蓝圆实时荧光PCR法 第2部分：日本靖实时荧光PCR法 第3部分：沙丁鱼实时荧光PCR法 第4部分：秋刀鱼实时荧光PCR法 第5部分：竹策鱼实时荧光PCR法 第6部分：鱼实时荧光PCR法 第7部分：蓝点马实时荧光PCR法 本文件为T/HBIQA0003.4-2024，第4部分.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.
本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由河北省检验检疫学会提出并归口.
本文件起草单位：石家庄海关技术中心、中国海关科学技术研究中心、石家庄市食品药品检验中心、 河北三狮生物科技有限公司.
本文件主要起草人：王建昌、王金风、艾连峰、姜彦芬、陈志敏、董振国、刘立兵、蒲静、孙晓霞.
T/HBIQA 0003.42024 食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法 第4部分：秋刀鱼实时荧光PCR法 1范围 本部分规定了食品中秋刀鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法.
本部分适用于食品中秋刀鱼源性成分的定性检测.
本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1% （质量分数）.
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准.
3.1秋刀鱼 Cololabis saira 又称竹刀鱼，属于颌针鱼目（Beloniformes），竹刀鱼科（Sberesocidae），秋刀鱼属（Cololabis）.
3.2实时荧光PCRreal-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程.
3.3 Ctf cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数.
下列缩略语适用于本文件.
4.1PCR：聚合酵链式反应（Polymerase chain reaction） 4.2DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） 4.3Cytb：线粒体细胞色素b基因（Cytochromeb gene） 4.4dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 4.5CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） 4.6Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane） 4.7EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetracetic acid） 4.8FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） 4.9BHQ1：黑洞淬灭基团1 5原理 实时荧光PCR法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个反应进程.
提取样品DNA为模板，以秋刀鱼Cyrb基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光 PCR扩增，根据实时荧光PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对秋刀鱼成分的定 性分析.
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T/HBIQA 0003.42024 6试剂和材料 6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格.
6.2检测用引物和探针序列见表1.
表1引物和探针序列 名称 序列（5-3） 目的基因 F: TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 真核生物 内参照 R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 18Sr RNA P:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1 基因 F: TATTGCAACAGCCTTCTCATCAG 秋刀鱼 R:TTGCATGCATATTTCGGATAAGTC Cyrb基因 P:FAM-CGCCCATATCTGCCGAGACGTGA-BHQ1 6. 3 CTAB裂解液： 20 g/L CTAB 0.1 mol/L Tris-HCI (pH 8.0)， 1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA （pH8.0).
6.4CTAB沉淀液：5g/L CTAB，40mmol/LNaC1. 6.5蛋白酶K（20mg/mL），-20C条件下保存.
6.6三氯甲烷，分析纯.
6.7异丙醇，分析纯.
6.875%乙醇，分析纯无水乙醇配制.
6.9荧光PCR预混液（2×）.
6. 10TE 缓冲液 （Tris-CI、EDTA 缓冲液)：10 mmol/L Tris-HCI(pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0).
7 仪器和设备 7.1实时荧光定量PCR仪.
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.
7.3恒温水浴锅.
7.4离心机：最大离心力要超过12000g 7.5微量移液器（0.1 μL~2.5 μL 1μL~10μL 10 μL~100μL 20μL~200 μL 100μL~1000 μL）.
7.6研钵及粉碎装置.
7.7涡旋震荡仪.
7.8pH计：精度为0.1.
7.9分析天平：精度为0.01g.
7.10超净工作台.
7.11均质器.
8检验步骤 8.1样品前处理 鱼罐头、鱼肠、鱼丸等食品取肉糜300mg，置于三氯甲烷：甲醇：水混合溶液(1:2:0.8)中室温孵育过 夜，去除油脂的肌肉组织可用于核酸提取： 鱼肉、鱼排、鱼糜等鱼肉制品取300mg，用生理盐水清洗后，放入研体中，在研钵中倒入液氮， 将样品在液氮中研磨成粉末或用冷冻研磨仪研磨成粉末.
8.2DNA提取
T/HBIQA 0003.42024 称取50mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mLCTAB裂解液和10μL蛋白酶K， 振荡混匀，65℃下孵育30min，期间每隔10min振荡混匀.
12000r/min离心5min，吸取上清液至 一新离心管中，加400gL三氯甲烷：异戊醇（24:1）溶液，充分混匀.
12000r/min离心5min，吸取 上清液至另一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后室温下静置1h.
12000r/min离心10 min，弃上清液：70%乙醇洗涤一次，晾干：加入50μLTE，溶解沉淀即为DNA溶液，于-20C保存 备用.
也可用等效的商业化DNA提取试剂盒提取样品DNA.
8.3DNA浓度和纯度的测定 取适量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别测定260nm和280nm处的吸光 值A2和A2so.
DNA的浓度按照公式（1）计算： c=A2s×N×50 公式（1）中： c-DNA浓度，单位为微克每微升（μguL）： A26 -260nm处的吸光值： N--核酸稀释倍数.
当A26/A2so比值在1.7～2.0之间时，适宜于实时荧光PCR扩增.
8.4实时荧光PCR检测 8.4.1实时荧光PCR反应体系 混合液.
表2实时荧光PCR反应体系 试剂名称 终浓度 反应体系/L Premix Ex TaqM (2× ) 1× 12.5 F(10 μmol/L) 400 nmol/L 1 R(10 μmol/L) 400 nmol/L 1 P(10 μmol/L) 400 nmol/L 1 DNA模板(50-100 ng/μL) - 2.0 补水至 25 8.4.2扩增条件 混匀离心后置于实时荧光PCR仪上进行扩增，扩增条件为：95C预变性30s：95℃15s，60℃35 s（收集荧光信号），40个循环.
不同仪器可根据仪器要求将实时荧光PCR反应条件作适当调整.
8.4.3试验对照 检验过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照.
以秋刀鱼提取的DNA为阳性对照，以已 知不含有秋刀鱼的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照.
样品、阳性对照、阴性对 照、空白对照各设置两个平行.
9质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： a）空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0.
