ICS 07.060 A 45 HY 中华人民共和国海洋行业标准 HY/T0295-2020 海绵种属分子鉴定技术规程 Specification of identifying sponge based on molecular data 2020-06-28发布 2020-10-01实施 中华人民共和国自然资源部 发布
HY/T0295-2020 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国自然资源部提出.
本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口.
本标准起草单位：大连海洋大学、中国科学院大连化学物理研究所、大连金普新区农业农村发展服 务中心.
本标准主要起草人：付晚涛、曹旭鹏、杜萌萌、苏廷明、王刚、吴孟嘉、张世杰、李东子、沈思思、 丁小涵、王玄、肖一帆、王少杰、鲁艳莉、李晶莹.
HY/T 0295-2020 海绵种属分子鉴定技术规程 1范围 本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的原理与方法、海绵样品采集与保存.
本标准适用于海绵的样品采集、保存和分子生物学方法种属鉴定.
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T12763.6-2007海洋调查规范第6部分：海洋生物资源调查 GB/T30744-2014深海微生物样品前处理技术规范 HY/T058-2010海洋调查观测监测档案业务规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3.1 海绵sponge 目前已知仍然生存的最古老、最低等的多细胞动物，在动物界中单独构成多孔动物门.
3.2 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，用于快速准 确识别、鉴定物种.
3.3 海绵条形码sponge barcode 海绵的保守基因序列信息的一种表述形式.
3.4 18S rRNA 基因18S rRNA gene 编码18SrRNA基因的DNA序列.
3.5 细胞色素氧化酶亚基Icytochrome oxidase subunitI 编码线粒体细胞色素氧化酶亚基I（Cytochrome oxidase subunitI）基因的DNA序列.
注：以下简称COI 3.6 聚合酶链式反应polymerase chainreaction DNA模板先经高温变性为单链，在适宜温度下和缓冲液中，两条引物分别与模板DNA两条链上 的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸，如 此反复变性、退火和延伸，使位于两段引物序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增.
HY/T 0295-2020 4原理 通过聚合酶链式反应（简称PCR）分别扩增海绵的18SrDNA和COIDNA的部分序列，测序获得 各自序列信息后分别与已经鉴定的海绵18SrDNA和COIDNA序列比对，以此鉴定海绵种属.
5仪器与设备 5.1野外生物样品保存箱或保温箱.
5.2低温冰箱.
5.3研体.
5.5水浴锅.
5.6高速低温冷冻享 心机.
5.7 紫外分光光度 计.
5.8 聚合酵链式 成反应 DNA扩增仪（简称PCR仪）.
5.9电泳仪.
5.10高压 菌钢 5.11酒精 5.12液氢 罐. 6试剂与材料 注：除非另有规定：使用试剂均发 步析线 6.1无水2醇.
6.270%乙.
6.3液氮.
6.4异丙醇.
6.5浓硝酸或浓盐酸.
6.6浓硫酸. 6.7 蒸馏水或去离子水 6.8蛋白酶K. 6.9Taq酶.
6.10琼脂糖.
6.11 醋酸钾溶液（配方见附录A).
6.12 细胞裂解缓冲液（配方见附录A).
6.13TE缓冲液（pH7.6)（配方见附录A）.
6.14 10XPCR缓冲液（配方见附录A). 6.15 吸管.
6.16 载玻片.
6.17 采样袋或采样瓶.
6.18 聚丙烯离心管.
HY/T 0295-2020 7海绵样品采集与保存 7.1海绵样品采集 首先，对于海绵及其周围环境，先拍照或摄像；此外，按照GB/T12763.6-2007中10.2规定执行.
7.2海绵样品保存 7.2.1暂时保存 保存箱，有条件时，直接放人冰箱冷藏保存，保存时间1天 7.2.2短期保存 暂时保存在无水乙醇中1天海绵样品，需要更换全部无水乙醇，然后冷涂保存周.
7.2.3长期保存 暂时保存在无水乙醇中1天海绵样品或采集海丝样品需要转称至一20C保存.
在一20C保存约 2周时间，需要更换全部无水乙醇乙停加大量与海绵样品的体积比同样为（15）：1然后可继续放在 -20C保存在一20C继续保存药3个月，需要重换全部无水么醇热后继线放在一20保存.
由 此，在一20C条件，可以按此方法连续保存1 7.3海绵样品记录 海绵样品采集与保存记录主高绵资源调查采样表 见附 8海绵种属分子生物学鉴定方法 8.1海绵DNA提取与练化 8.1.1取出保存在乙醇中的海绵样品，在样品几何中心部位取样品约0.5 放人事 先用液氮预冷的研 体中，加人液氮研磨海绵样品成稳末状.
8.1.2将上述研磨成粉末的海绵样品量约1/5移人装有600pL细胞数解缓冲液的聚丙烯离心管中混 匀，加人3μL蛋白酶K，在55C水浴锅上放置3h.
8.1.3从水浴钢取下装有海绵的离心管，在室温加人200pi醋酸钾溶液，振荡、混匀. 8.1.4将步骤8.1.3的离心管在4C、10000g离心力条件下离心3min，然后将上清液转移至装有 600uL异丙醇的1个新的聚丙烯离心管中，振荡、混匀， 8.1.5将步骤8.1.4的离心管在室湿、10000g离心力条件下离心3min，然后吸去上清液，加人600gL 乙醇（70%），振荡、混匀. 8.1.6将步骤8.1.5的离心管在室温、10000g离心力条件下离心3min，弃上清液.
8.1.7重复清洗DNA沉淀一次.
8.1.8将步骤8.1.7离心管中的上清液吸去，将离心管中DNA风干15min.
-80C保存.
8.1.10按照GB/T30744-2014中9.2.1规定，将步骤8.1.9收获的DNA进行纯度测定，满足要求的 DNA用于PCR扩增.
