ICS07.060;13.060 Z17 中华人民共和国海洋行业标准 HY/T151-2013 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法 Detection of hemolytic toxinsinmarinemicroalgae-Erythrocytelysis assay 2013-04-25发布 2013-05-01实施 国家海洋局 发布
中华人民共和国海洋 行业标准 海洋微藻中溶血毒素的检测血细胞法 HY/T151-2013 中国标准出版社出版发行 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013） 北京市西城区三里河北街16号（100045） 网址.spc.net.cn 总编室：（010）64275323发行中心：（010）51780235 读者服务部：（010）68523946 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销 开本880×12301/16印张0.75字数18千字 2013年6月第一版2013年6月第一次印刷 书号：1550662-25465 如有印装差错由本社发行中心调换 ：（010）68510107
HY/T151-2013 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家海洋局南海环境监测中心提出.
本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口.
本标准起草单位：国家海洋局南海环境监测中心、暨南大学.
本标准主要起草人：李秀芹、杨维东、黄楚光、徐志斌、高阳、彭颖慧、上官茂森、林端、方宏达、吴进孝、 董燕红、陈嘉辉、吴玲玲、曲念东、刘洁生.
HY/T 151-2013 海洋微藻中溶血毒素的检测血细胞法 1范围 本标准规定了用血细胞法检测海洋微藻中溶血毒素活性的方法及技术要求.
本标准适用于自然海水中海洋微藻细胞中溶血毒素的检测，也适用于实验室培养的海洋微藻细胞 中溶血毒素的检测.
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB17378.3-2007海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输 HY/T069-2005赤潮监测技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3.1 海洋微藻marinemicroalgae 海水中粒径大于2um的浮游植物.
3.2 溶血毒素hemolytictoxins 一类主要由微藻产生能够导致机体红细胞及其他真核细胞裂解的糖脂类物质，其主要作用于敏感 细胞的细胞膜脂质部分.
3.3 溶血活性hemolyticactivity 溶血毒素溶解血细胞的效力.
3.4 溶血单位hemolyticunits 用来表述溶血毒素活性的量纲.
1个溶血单位相当于在1mL反应系统中（含柠檬酸缓冲液 0.15mL、0.5%的兔血红细胞0.80mL和溶血毒素粗提液0.05mL），在37C水浴30min使红细胞溶 解50%时所需溶血毒素的量，相当于（1.30士0.39）μg洋地黄皂昔.
3.5 血细胞法erythrocyte lysisassay 针对溶血毒素破坏、溶解血细胞的特性建立的一种检测方法，该方法以溶血单位为量纲来定量溶血 毒素的溶血活性.
3.6 赤潮水样redtidewater 微藻细胞浓度达到或超过HY/T069-2005规定的基准浓度的海水样品.
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HY/T151-2013 3.7 非赤潮水样non-redtidewater 微藻细胞浓度未达到HY/T069一2005规定的基准浓度的海水样品.
4原理 利用氯仿、甲醇和水体积比为13：7：5的提取液萃取微藻细胞中的溶血毒素，经减压蒸馏浓缩后， 再以甲醇溶液溶解残留物，得溶血毒素粗提物；用粗提物溶解血细胞，同时配置洋地黄皂苷标准系列溶 液绘制工作曲线，结合粗提物的溶血情况计算溶血毒素的活性.
5试剂和材料 除非另作说明，本标准所用试剂均为分析纯，水是蒸馏水或者等效纯水.
5.1氯仿（CHCL）.
5.2甲醇（CHO）.
5.3柠檬酸（CHO HO）.
5.4洋地黄皂苷（CHO，99%）.
5.5氯化钠（NaCl）.
5.6柠檬酸钠（CHNaO2HO）.
5.7葡萄糖（CHO）. 5.8曲拉通X-100（CHO）.
5.9医用肝素钠注射液[（CHNSNa）2，5000IU/mL].
5.10提取液：氯仿、甲醇和水体积比为13：7：5.
5.11柠檬酸溶液（2mol/L)：称取柠檬酸（CHO，HO)42.0g，置于200mL烧杯中，用水溶解后 移人100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀备用.
要时可水浴加热），移人100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，备用.
5.13柠檬酸缓冲液：称取0.8532g氯化钠（NaCI），2.1680g柠檬酸钠（CHNaO 2HO)，4.5180g 葡萄糖（CHO），置于500mL烧杯中，用水溶解，用柠檬酸溶液（5.11）调pH值至7.0，移入250mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀备用.
5.14兔血红细胞溶液（0.5%，体积比）：取健康新西兰兔新鲜血液10mL，加人微量医用肝素钠注射 液，以1200r/min的转速离心10min，弃上清液，加人柠檬酸缓冲液（5.13），轻轻摇匀后再次同条件离 心，去上清液，反复三遍，直到上清液无色，根据离心后血细胞体积，用柠檬酸缓冲液（5.13）配成0.5% 血细胞溶液，当天使用.
6仪器设备 6.1分光光度计：需有540nm的吸收波段.
6.2烘箱.
6.3超声波细胞粉碎仪：配直径为2mm的变幅杆，超声功率可达200W.
6.4天平：感量0.1g.
6.5分析天平：感量0.1mg.
6.6光学显微镜：配有可放大倍数为40倍、100倍的物镜和目镜.
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