ICS 67.050 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T3020-2004 水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法 Determination of diethylstilbestrol residues in fishery products Enzyme linked immuno sorbent assay 2004-01-07发布 2004-03-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T30202004 前言 本标准的附录A和附录B均为资料性附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心.
本标准主要起草人：艾晓辉、刘长征、邹世平、徐忠法、李荣.
SC/T 3020-2004 水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法 1范围 本标准规定了水产品中已烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法.
本标准适用于水产品肌肉中已烯雌酚的测定.
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，的免疫反应都在微孔中进行，加人已烯雌酚标准 或样品溶液、已烯雌酚酶标记物、已烯雌酚抗体后，已烯雌酚与已烯雌酚酶标记物相互竞争已烯雌酚抗 体的结合位点.
结合的已烯雌酚酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm处检测， 吸收光强度与样品中的已烯雌酚浓度成反比，按校正曲线定量.
4试剂和材料 本标准所用试剂除标明外，其他均为分析纯及其更高纯度，试验用水符合GB/T6682一级水标准.
4.1叔丁基甲基醚：色谱纯.
4.2石油醚.
4.3二氯甲烷.
4.4甲醇：色谱纯.
4.5氢氧化钠：1mol/L.
4.6磷酸：6mol/L.
4.720%甲醇的20mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH8.5）.40%、70%、80%的甲醇溶 液，此溶液现用现配.
4.867mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）：9.61g磷酸氢二钠，1.79g磷酸二氢钠溶解于蒸馏水，定容至 1000mL，此溶液现用现配.
4.9已烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒，参见附录A.
5仪器与设备 5.1酶标仪：波长450nme 5.2离心机：转速4000r/min.
5.3氮吹仪.
5.4电热恒温水浴锅.
5.5高速匀浆机.
SC/T 3020-2004 5.6Cg固相提取柱：长6.5cm，内径0.7cmg 5.7固相萃取器.
5.8微型涡混合仪.
5.9振荡器.
5.10微量加样器:20μL、50μL、100L、250μL、1000 L.
5.11微量多通道加样器：50pL、100pL 6样品处理 6.1试样提取 取出鱼、虾、蟹、鉴等水产品肌肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于0.5cm×0.5cm× 0.5cm的小块后混匀，置冰箱中冷冻备用.
将样品解冻，取5g（精确到0.01g）样品于匀浆机的玻璃管中，加10mL67mmol/L磷酸盐缓冲液 （pH7.2）.充分匀浆，称取3g（精确到0.01g）匀浆组织于20mL玻璃离心管中，加人8mL叔丁基甲基 ，强烈振荡20min，4000r/min离心10min，转移出上清液至20mL玻璃离心管中，再用8mL叔丁基 甲基醚重复提取沉淀物，将两次提取的醚相合并，70C水浴蒸发至干.
取70%的甲醇1mL溶解干燥的残留物，加3mL石油醚洗涤甲醇溶液，激涡混合1min，4000r/ min离心1min，吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氯甲烷溶解，加1mol/L氢氧化钠溶 液3mL，涡振荡后静置，取出上层氢氧化钠溶液，加人6mol/L磷酸300pL中和提取液，用Cg固相 提取柱进一步纯化.
6.2样品纯化 将Cug固相提取柱垂直固定，用3mL无水甲醇洗涤柱子，再用2mL20%甲醇的20mmol/LTris缓 冲液（pH8.5）平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1000pL微量加样器全部加 人柱中，过柱，然后用2mL20%甲醇的20mmol/LTris缓冲液（pH8.5）洗涤柱子，接着用3mL40%的 甲醇洗涤柱子，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min以干燥柱子.
用2mL80%的甲醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为1滴/s左右，可用 固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加人2mL水，取20pL进行酶联免疫测定.
7酶联免疫测定 检查试剂盒中试剂是否齐全完好（参见附录A）.
控制室温至20℃～24C，取出足够数量的微 孔条插入微孔架中，加入20uL的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部，记录各标准液和样品的位 置，标准和样品做两个平行实验.
每个微孔中加人50μL稀释后的已烯雌酚抗体，微旅振荡混合，置 2C~8C冰箱中孵育20h 取出微孔架，回复到室温20℃～24C，洗板（甩出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3 次，以保证完全除去孔中的液体.
用250pL蒸馏水充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次）， 加人50uL稀释的酶标记物到微孔底部，微旅振荡充分混合后，置室湿孵育1h，再洗板后（同上述洗板 方法），每个微孔中加人50pL基质和50pL发色试剂，充分混合，并在室温暗处孵育30min，每个微孔 中再加人100L反应停止液，混合后在60min内满量并记录每个微孔450nm处的吸光度值.
8结果计算 8.1计算相对吸光度值 5 计算每个已烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值，按公式（1）求出已烯雌酚标准液和样液的相对吸 光度值.
2
SC/T3020-2004 R;=A;/Ag×100 式中： R一相对吸光度值，单位为百分比（%）； A一空白标准的吸光度值； A一标准或样品的平均吸光度值.
8.2绘制校正曲线 以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标，以已烯雌酚浓度的对数为横坐标，绘制出已烯雌酚标准液 相对吸光度值与已烯雌酚浓度的校正曲线（参见附录B)，校正曲线在0.05pg/L~0.4pg/L范围内应当 成为线性，相对应每一个样品的己烯雌酚浓度可以从校正曲线上读出.
每次试验均应重新绘制校正曲 线.
8.3结果计算 在8.2绘制的校正曲线上读出的相对应每一个样品的已烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（本标 准所采用的稀释系数为4）.即为试样中的己烯雌酚残留量.
9检测限、回收率 9.1检测限 本方法的检测限为0.6μg/kg.
9.2回收率 本方法的回收率≥70%.
