ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7201.2-2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法 Rules for quarantining bacterial diseases of fish Part 2:Diagnostic method for gill-rot disease 2006-12-06发布 2007-02-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T 7201.2-2006 前言 SC/T7201《鱼类细菌病检疫技术规程》分为五个部分： 一第1部分：通用技术； -第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法； 第3部分：嗜水气单胞菌及脉鼠气单胞菌肠炎病诊断方法； 一第4部分：荧光假单胞菌赤皮病诊断方法； 一第5部分：白皮假单胞菌白皮病诊断方法.
本部分为SC/T7201的第2部分.
本部分的附录A和附录B为规范性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、中国水产科学研究院珠江水产研究所.
本部分主要起草人：何力、邹为民、徐忠法、姜兰、周瑞琼、罗晓松.
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SC/T 7201.2-2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法 1范围 本部分规定了鱼类柱状嗜纤维菌细菌性烂鳃病（bacterialgill-rotdiscase)的诊断方法.
本部分适用于鱼类细菌性烂鳃病的诊断.
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分.
SC/T7014-2006水生动物检疫实验技术规范 SC/T7201.1-2006鱼类细菌病检疫技术规范第1部分：通用技术 3病原体与流行情况 3.1主要病原体 柱状噬纤维菌（Cytophagacolumnaris）.
曾用名：柱状嗜纤维杆菌、柱状屈挠杆菌、鱼害黏球菌.
3.2流行情况 在青鱼、草鱼、鲢、瓣、鲤、鲫、鲫、鳗幅等鱼中都可发生，但主要危害草鱼；各地一年四季出现；水温 20℃以上开始流行，28℃～35℃为最适流行温度.
4试剂 除非另有说明，在检验中仅使用确认为分析纯的试剂、蒸馏水或去离子水.
常用试剂与染色液的配 制按SC/T7201.1-2006中附录A的规定执行.
微生物生化鉴定管可代替相应的试剂.
4.1辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体.
4.21%盐酸四甲基对苯胺.
4.33.3-二氨基联苯四盐酸盐（DAB）酶底物（见附录A）.
4.4pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录B）.
4.5pH7.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（见附录B）.
4.6免抗柱状噬纤维菌抗血清.
5培养基 5.1胰陈琼脂培养基.
5.2Christcnscn氏枸橡酸培养基.
5.3硝酸盐液体培养基.
常用培养基的配制见SC/T7201.1-2006附录B中的B.4.
6设备和器械 应符合SC/T7201.1-2006第4章的规定.
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SC/T 7201.2-2006 7采样 遵照SC/T一2006第4章的规定.
8临床诊断 8.1活动情况 病鱼活动缓慢，对外界的刺激反应迟钝，呼吸困难，食欲减退；病情严重时，离群独游水面，不吃食.
8.2外部检查 体色发黑，尤以头部为甚；鳃丝上黏液增多，鳃丝肿胀，末端腐烂，软骨外露；鳃丝上常附着有较多污 物，不宜用水洗净；病情严重时，盖内表面表皮充血发炎，中间常糜烂成一圆形或不规则的透明部分.
8.3镜检 剪取少量病灶处鳃丝放在载玻片上，加上2滴～3滴无菌水（或清水），盖上盖玻片，在400倍至600 倍显微镜下观察.
鱼体鳃上无大量寄生虫或真菌，放置20min～30min，可见丝上有大量细长、滑行 的杆菌，有些菌体聚集成状.
9实验室诊断 9.1病原菌的分离 9.1.1平板划线分离 取病鱼丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片的边缘约10min，用接种环水，在胰陈琼脂培养基 平板上划线.
可采用平板划线方法，不重复的划线，需尽量使其产生单个分散的菌落.
在25℃恒温培 养2d~3d.
9.1.2纯培养 遵照SC/T7201.1-2006的7.2.3的规定.
9.2菌落形态 在胰陈琼脂培养基平板上25℃培养2d左右，出现稀薄的、平铺在培养基表面的菌落，边沿不整齐， 中央较厚，大小不一，颜色由浅逐渐变成黄色.
9.3革兰氏染色 在一干净载玻片上滴加一滴蒸馏水.
用接种环取菌落少许与蒸馏水混合并均匀涂布，自然干燥，火 焰固定；加草酸铵结晶紫染液染1min~2min，加水冲洗；加革兰氏碘液作用1min~2min，加水冲洗；加 复红酒精染液染50s~60s，加水冲洗.
干燥，镜检.
菌体被染成紫蓝色为阳性，红色为阴性.
9.4生化检验 利用全自动细菌分析仪和细菌生化鉴定管可简化相应试验过程.
9.4.1明胶液化试验 在胰陈培养液中加人12%的明胶，pH7.2，用高压蒸汽121C、30min灭菌.
取菌落接种培养2d~3 d后用二氯化汞浇淹培养基，有液化明胶的区域出现为阳性.
9.4.2酪素水解试验 在胰陈培养基中加人2%脱脂牛奶制成平板，接种2d后，平板上有酪素水解的亮斑为阳性.
9.4.3淀粉水解试验 胰陈培养基加0.2%可溶性淀粉.
接种培养2h~3h加碘液于平板上，蓝背景中有明亮的水解区 城为阳性.
9.4.4七叶灵水解试验 在0.5%的胰蛋白陈，加0.1%的七叶灵，0.05%的柠檬酸铵铁，2%的琼脂培养基上，接种培养、观 20
SC/T 7201.2-2006 察7d，菌落周围有黑色沉淀物为阳性.
9.4.5几丁质分解试验 用0.1%的胰蛋白陈加人0.5%几丁质，0.2%琼脂的培养基盖于无营养琼脂平板上.
接种培养、观 察7d.
菌落周围出现透明圈为阳性.
9.4.6分解纤维素的试验 在胰陈培养液中加滤纸条.
接种观察10d，滤纸条有缺刻或断裂等分解现象为阳性.
9.4.7酪氨酸分解试验 在胰陈培养液中加0.5%的酪氨酸，接种培养观察两星期（14d），酪氨酸被分解而透明为阳性.
9.4.8硝酸盐还原试验 在硝酸盐液体培养基上接种培养24h后，滴加格里斯氏（Gries）试剂（配制见SC/T7201.1-2006 附录A中的A.2）各几滴.
10min内显红色为阳性.
9.4.9靛基质试验 1%的胰蛋白陈水液，接种培养2d后，滴加乙醚数滴，摇动，乙醚浮于上层，再沿管壁滴加Kovacs试 剂约0.5mL.
两液接触处即刻呈玫瑰色为阳性.
9.4.10硫化氢试验 1%的胰蛋白陈水液，接种培养2d～4d，用醋酸铅粉加人试管中观察.
有黑色沉淀为阳性.
9.4.11构橡酸盐利用试验 用Christensen氏枸橡酸培养基，接种培养，观察7d.
培养基由氯变蓝者为阳性.
9.4.12过氧化氢酶试验 取一杯培养物与3%～10%的过氧化氢混合，有气泡产生者为阳性.
9.4.13葡萄糖利用试验 胰陈液体培养基加1%葡萄糖，0.0015%溴麝香草酚蓝.
培养基变黄色为阳性.
9.5免疫学检验 用弯头镊子取新鲜病鱼鳃上的少量淡黄色黏液，涂于载玻片上，自然晾干；加几滴柱状噬纤维菌兔 抗血清于该载玻片的涂片区，将载玻片置于湿盒内，在37C温育30min；用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3 次~4次，每次3min～5min，再加几滴HRP-羊抗兔IgG抗体后，置于湿盒内，在37℃温育30min；用 PBS洗3次~4次，每次3min~5min，加几滴DAB酶底物，反应6min~8min，用pH7.6Tris-HCi缓冲 液洗30min；加一滴甘油封存涂片区，覆上盖玻片.
普通显微镜油镜下观察.
10结果判定 血清学检验，涂片上有棕色细长颗粒，颗粒大小与杆菌一致，或生化检验符合以下特性者可判 定病原菌为柱状噬纤维菌： a）菌落形态特征符合9.2的规定，革兰氏染色为阴性； b）明胶液化试验、酪素水解试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验为阳性； 试验、硫化氢试验、枸橡酸盐利用试验、过氧化氢酶试验、葡萄糖利用产气试验为阴性.
临床诊断结果符合8的规定，病原菌为柱状噬纤维菌，可判定为细菌性烂鳃病.
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