ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7202.1-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第1部分：压片显微镜检查法 Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus(MBV) of Penaeid Shrimp- Part 1:MicroscopyMethodwith Wet Mount 2007-06-14发布 2007-09-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T7202.1-2007 前言 SC/T7202《班节对虾杆状病毒病诊断规程》分为三个部分： -第1部分：压片显微镜检查法； 第2部分：PCR检测法； 一第3部分：组织病理学诊断法.
本部分为SC/T7202的第1部分.
本部分的附录A、附录B为规范性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦.
SC/T 7202.1-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第1部分：压片显微镜检查法 1范围 SC/T7202的本部分规定了班节对虾杆状病毒病压片显微镜检查法的原理、试剂与材料、仪器设 备、操作步骤和结果判定.
本部分适用于对虾活体及其粪便中的班节对虾杆状病毒（MBV）核型多角体的检测，其中对粪便的 检查可用于进行非致死性的疾病筛查和诊断.
不适于对病毒非感染性携带的标本进行诊断，以及对宿 主进行组织病理学评价.
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.3-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法 3原理 3.1斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征见SC/T7202.3一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规 程第3部分：组织病理学诊断法）中3.1的规定.
3.2通过光学显微镜观察新鲜组织样品或粪便中近球形的MBV核型多角体形成的情况，可初步诊断 被检样品是否感染MBV.
直接压片法是利用包涵体较高的折射率进行区分，孔雀石绿染色法是利用包 涵体着色较深区分，压片焰红染色法是用荧光显微镜观察经焰红染料染色的包涵体激发出的荧光来判 断.
4试剂和材料 4.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水.
4.20.05%孔雀石绿染液按附录A的规定.
4.30.001%焰红染液按附录A的规定.
4.4自然海水经沉淀去除悬浮物.
5仪器设备 5.1显微镜：压片孔雀石绿染色法只需要普通明视野显微镜即可，直接压片法推荐使用相差显微镜，压 片焰红染色法需要荧光显微镜（阻挡滤光片波长为520nm，激发滤光片波长为450nm~490nm）.
5.2载玻片.
5.3盖玻片.
5.4医用镊子.
5.5解剖刀.
5.6水族箱.
SC/T 7202.1-2007 5.7塑料虹吸管并接有一段塑料吸管尖头.
5.8玻璃试管.
5.9吸水纸.
6操作步骤 6.1样品的准备 6.1.1样品采集的要求见附录B.
6.1.2组织样品：幼体取整体，仔虾取头胸部，幼虾和成虾取小块肝胰腺或小截中肠组织.
6.1.3粪便样品：将幼虾或成虾暂养于水族箱中，待数小时直至水族箱底部出现粪便.
用干净的塑料 虹吸管吸取排泄物，注人玻璃试管中.
6.2直接压片法 将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，盖上盖玻片，用明视野显微镜调小光圈观 察，或用相差显微镜观察.
6.3压片孔雀石绿染色法 将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，滴加1滴～2滴0.05%孔雀石绿染液，混 匀，染色2min～4min，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体，将制备好的压片置于明视野显微镜下观 察.
6.4压片焰红染色法 将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，滴加1滴一2滴0.001%焰红染液，混匀， 染色2min~4min，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体，将制备好的压片置于荧光显微镜下观察.
7结果判定 7.1直接压片法：显微镜下可观察到受MBV感染的对虾肝胰腺或中肠的上皮细胞核肿大，核内有单 个或多个折射率高的球形包涵体，单个包涵体直径约为0.1gm～20um.
受MBV感染的对虾粪便压片 可观察到带折光性的近似球形的包涵体，大小约20pm，在新鲜粪便中，MBV包涵体常成团聚集，并被 核膜包裹着.
7.2压片孔雀石绿染色法可观察到包涵体着色发绿，与正常的细胞核、核仁、分泌颗粒或吞噬溶酶体和 脂肪滴等其他球形体相比，包涵体着色更深.
7.3压片焰红染色法在荧光显微镜下可见到在浅绿色的背景中，核型多角体的包涵体呈明亮的黄绿色 荧光，而组织中的其他成分没有荧光.
7.4观察结果找到多个有大量或簇集的典型包涵体的视野可作为确诊的依据；诊断结果可疑时，补充 组织病理诊断法或PCR检测进行结果确认.
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SC/T 7202.1-2007 附录A （规范性附录） 试剂配方 A.10.05%孔雀石绿染液 孔雀石绿（水溶性） 0.05g 加水溶解定容至室温贮存.
100 mL A.21%焰红贮存液 焰红B（水溶性） 1g 水 100 mL 溶解后置于棕色瓶中，室温贮存.
A.30.001%焰红染液 1%焰红贮存液 0.1 mL 水 100 mL
