ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus (MBV) ofPenaeid Shrimp- Part2:PCRMethod 2007-06-14发布 2007-09-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T7202.2-2007 前言 SC/T7202《班节对虾杆状病毒病诊断规程》分为三个部分： 一第1部分：压片显微镜检查法； 第2部分：PCR检测法； 一第3部分：组织病理学诊断法.
本部分为SC/T7202的第2部分.
本部分的附录A和附录B为规范性附录，附录C为资料性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站.
本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦.
SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 1警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出可能的安全问题.
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件.
2范围 SC/T7202的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病PCR检测法的原理、试剂与材料、仅器设备、操作 步骤和结果判定.
本部分适用于进行病原筛查和疾病的确诊.
其中核型多角体基因保守序列法仅适用于对虾，包括 对虾活体、粪便，以及冰冻和冰鲜虾产品的MBV的筛查和疾病的初步诊断.
单独使用时不适于对病毒 量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估.
3规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法 SC/T7202.3-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法 4原理 4.1斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征 见SC/T7202.3一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法）中3.1的 规定.
4.2技术原理 聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是以待测样品的一段DNA作为模板，以与模板两 端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖DNA 的DNA聚合酶的合成作用.
经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的 毒DNA的存在.
套式PCR是在第一步PCR扩增的产物内，再用一对引物进行第二步PCR扩增.
5试剂和材料 5.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.
5.2无水乙醇.
5.3液体石蜡.
5.4含氯消毒剂：医用品或水产药物.
5.5琼脂糖：电泳级.
5.61kbDNA分子量标准：生化试剂.
SC/T7202.2-2007 5.710×PCR缓冲液：生化试剂，随TaqDNA聚合酶提供，-20C保存.
5.8MgCl（25mmol/L）：生化试剂，-20℃保存.
5.9dNTP(10mmol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物，-2C保 存.
5.10TaqDNA聚合酶（5U/μL)：生化试剂，-20C保存.
5.1110 μmol/L引物F1:5'-ACY-TAY-GTG-TCA-GAC-AAC-AAA-TAY-TAC-AAA-3'，序列含有简并 碱基，其中：Y=T或C，用于杆状病毒多角体基因保守序列法，-20C保存.
5.1210μcmol/L引物R1:5'-GGY-GCG-TCK-GGY-GCA-AAY-TTY-TTW-ACY-TTR-AA-3'，序列含有 简并碱基，其中：Y=T或C，K=T或G，W=A或T，R=A或G，用于杆状病毒多角体基因保守序列法， -20℃保存.
5.13TE缓冲液按附录A的规定执行.
5.14抽提缓冲液按附录A的规定执行.
5.1510mol/L乙酸铵按附录A的规定执行.
5.16平衡酚按附录A规定执行.
5.17酚/氯仿/异戊醇（25：24:1）按附录A的规定执行.
5.181×电泳缓冲液按附录A的规定执行.
5.196×载样缓冲液按附录A的规定执行.
5.2010mg/mL澳化乙锭（EB）贮存液按附录A的规定执行.
5.2170%乙醇按附录A的规定执行.
5.22阳性对照为已知MBV阳性的组织或粪便样品的DNA模板，-20C保存.
5.23阴性对照为已知MBV阴性的组织或粪便样品的DNA模板，-20C保存.
5.24空白对照以无菌双蒸水为模板.
6仪器设备 6.1PCR仪.
6.2电泳仪：输出直流电压0V~600V.
6.3水平电泳槽：50mL~500mL，带有5cm~20cm宽度的凝胶船及相应的样孔梳.
6.4紫外观察仪：可遮挡可见光干扰，在230nm～300nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相机架.
6.5台式高速离心机：转速12000r/min以上.
6.6手掌型离心机：塑料转头，转速2000r/min~4000r/min.
6.7水浴锅.
6.8普通冰箱：具冷藏箱，并带-18℃以下冷冻箱体.
000~000~00~0~069 6.10电炉或微波炉等其他加热设备.
维信息服务 6.11医用剪刀.
6.12医用镊子.
6.13三角烧瓶：容量100mL~250mL.
6.14玻璃研磨棒或塑料研磨棒：用于在1.5mL塑料离心管中研磨样品.
6.151.5mL塑料微量离心管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用.
6.16灭菌0.2mLPCR管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用.
2
SC/T 7202.2-2007 6.17微量移液器枪头：经高压蒸汽灭菌，一次性使用.
6.18塑料或乳胶手套.
6.19吸水纸.
7操作步骤 7.1杆状病毒多角体基因保守序列法 7.1.1反应体系的准备 7.1.1.1PCR反应可选择25gL、50gL或100L反应体系进行.
7.1.1.2在PCR前区按表1的要求，加人除Taq酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物.
按10 份/支或100份/支分装，保存于-20℃.
在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加人 相应体积的Taq酶，混匀，即成完全的反应预混物.
按1份/支分装到0.2mLPCR管中.
如果PCR仪 不具备热盖功能，再向各管内加人50L液体石蜡.
暂存于4C.
表1100份PCR反应预混物所需试剂组成 试剂 25L体系 50L体系 100gL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液 250 pL 500 μL 1 000 μL 1x MgC)(25 mol/L) 200 μL 400 μL 800L 2.0 mol/L dNTP(10 mmol/L) 50L 100 μL 200 200 μmol/L 引物 F1(10 μmol/L) 37.5 μL 75 p 150pL 0.15 μmol/L 引物R1(10 μmol/L) 37.5 pL 75 pl 150 μL 0.15 pemol/L 灭菌双燕水 1815 μ 3 630 μL 7 260 μL " TaqDNA聚合酶（5U/μL） 10 μL 20 L 40 μL 0.02 U/μL 100份反应总体积 2 400 μl 4 800 μL 9 600 l 注：25L体系模板量1pL/反应管：50gL体系模板量2L/反应管；100gL体系模板量4gL/反应管.
7.1.2样品准备 7.1.2.1样品采集的要求按SC/T7202.1-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显 微镜检查法）附录B的规定执行.
7.1.2.2活体或冰冻幼体、仔虾个体样品约5mg～100mg（去掉幼虾眼）；活体或冰冻幼虾或成虾肝胰 7.1.2.3必须避免各样品间的交叉污染.
非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配 制的有效氯含量为3.0×10-3的含氯消毒剂中5min，经无PCR产物污染的自来水充分清洗，再经蒸馏 水淋洗后方可用于下一个样品.
7.1.3DNA的提取 7.1.3.1样品DNA的提取应在样品区完成.
7.1.3.2在样品剪碎后加人抽提缓冲液500guL，用研磨充分研磨，37C温浴1h.
7.1.3.3加人2.5pL20mg/mL蛋白酶K，至终浓度100pg/mL，混匀后置于50C水浴3h，不时旋动.
7.1.3.4将溶液冷却至室温，加人等体积平衡酚，倒混合10min，于10000r/min离心3min分离两 相.
7.1.3.5水相移至新塑料微量离心管中，加人等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混合10min，于10000r/ rmin离心1min分离两相.
