ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7202.3-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第3部分：组织病理学诊断法 Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus(MBV) ofPenaeid Shrimp- Part3:HistopathologyMethod 2007-06-14发布 2007-09-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T7202.3-2007 前言 SC/T7202《斑节对虾杆状病毒病诊断规程》分为三个部分： 第1部分：压片显微镜检查法； 第2部分：PCR检测法； -第3部分：组织病理学诊断法.
本部分为SC/T7202的第3部分.
本部分的附录A为规范性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站.
本部分主要起草人：黄捷、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦.
SC/T 7202.3-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第3部分：组织病理学诊断法 1范围 SC/T7202的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病组织病理学诊断法的原理、试剂与材料、仪器设 备、操作步骤和结果判定.
本部分适用于对虾感染MBV情况的确诊或未知疾病样品的组织病理学评价.
不适于对病毒的非 感染性携带的标本进行病毒检测.
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法 3原理 3.1斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征 班节对虾杆状病毒（Penaeusmonodon-type baculovirus MBV）是封闭性杆状病毒，核酸类型为双链 DNA，按国际病毒分类委员会的命名规则，MBV也被称为PmSNPV（斑节对虾单粒包膜的核型多角体 病毒）.
MBV是宿主虾的幼体、仔虾和早期幼虾的潜在严重病原，该病毒具有广泛的宿主范围，其感染的特 征是在感染的肝胰腺和中肠上皮细胞中存在细胞核内的包涵体，即核型多角包涵体，该包涵体也可在粪 便中游离存在.
拥挤、化学药物胁迫或环境胁迫可增强MBV在宿主中的流行，其传播途径主要是有自 相残食和类一口途径的经口传播.
3.2技术原理 苏木精一伊红（H-E）染色在组织学和病理学中是一种常规染色方法.
通过染色液-苏木精和伊 红与组织细胞的不同组分分别相结合，使细胞核、细胞质和细胞内其他结构产生反差明显的蓝紫色和红 色，而可清晰地观察到各种不同的组织结构病理变化.
4试剂和材料 4.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.
4.2石蜡（熔点52℃~54℃）：切片级.
4.3二甲苯.
信息服务 4.4无水乙醇.
4.595%乙醇.
4.6过滤海水：盐度为20~30的海水在室内放置1周后，经滤纸和0.22pm滤膜过滤.
4.7戴维森氏AFA(Davidson'sAFA)固定液按附录A的规定执行.
4.8迈尔一班尼特苏木精（Mayer-BennettHematoxylin）染色液按附录A的规定执行.
SC/T 7202.3-2007 4.9伊红一焰红染色液按附录A的规定执行.
4.10黏片剂按附录A的规定执行.
4.1185%乙醇按附录A的规定执行.
4.1280%乙醇按附录A的规定执行.
4.1375%乙醇按附录A的规定执行.
4.1450%乙醇按附录A的规定执行.
4.15阳性对照为受MBV感染的对虾制成的组织切片.
4.16阴性对照为未受MBV感染的对虾制成的组织切片.
5仪器设备 5.1石蜡切片机：满足4um~7gmm厚度的石蜡连续切片要求.
5.2程控组织脱水机或使用手工脱水步骤.
5.3石蜡包埋机或使用手工包埋步骤：满足石蜡切片机对石蜡块规格的要求.
5.4程控切片染色机或使用手工染色步骤.
5.5展片水浴锅：散口，无盖水浴锅.
5.6平板烘片机：室温~100℃.
5.7显微镜：带高倍镜（40×）和油镜（100×）.
5.8毛笔.
5.9小镊子.
5.10载玻片.
5.11盖玻片.
5.12玻片架.
5.13荧光显微镜（阻挡滤光片波长为520nm，激发滤光片波长为450nm~490nm）.
6操作步骤 6.1样品准备 6.1.1样品采集的要求和固定方法按SC/T7202.1-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部 分：压片显微镜检查法）附录B的规定执行.
6.1.2在制作切片前，按照SC/T7202.1一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规定第1部分：压片显 微镜检查法）附录B的方法进行取材修整，要保证对虾的肝胰腺或中肠能被切片和染色.
6.2脱水 75%乙醇(1h 45 min）→85%乙醇(1 h 45 min)→85%乙醇(1h 45 min)→95%乙醇（45 min)→95% ））） 6.3透明 无水乙醇-二甲苯（1:1）（25min）→二甲苯（20min）二甲苯（20min）.
6.4浸蜡 纯石蜡（1h20min）一纯石蜡（1h20 min）.
6.5包埋 用石蜡包埋机进行包理.
6.6切片 2
SC/T7202.3-2007 用石蜡切片机切片，厚度5μm.
对每个石蜡包埋块至少切取两块不连续的切片.
6.7展片 展片水浴锅（40℃）中展片，用涂有一层黏片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45C烘片2h.
6.8染色 二甲苯（5min）→二甲苯（5min）→无水乙醇（2min）→无水乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→95% ）（）（）%0（）%08（）%08（） min）→蒸馏水（2min）→迈尔-班尼特苏木精（Mayer-Bennett Hematoxylin）染色液（5min）→缓慢流动 的自来水（6min）→伊红一焰红染色液（2min）→95%乙醇（1min20s）→95%乙醇（2min）→无水乙醇（2 （s0）由（0）由（s0）由（）（ 6.9封片 滴加2滴中性树胶封片.
6.10观察 明视野显微镜下观察.
7结果判定 7.1感染有MBV的对虾肝胰腺细胞的细胞核明显肥大，内有单个或多个近球形的核型多角体型包涵 体，使染色质减少并向边缘迁移.
在中肠上皮细胞中也偶尔可看到类似的现象，包涵体呈亮红色.
肝胰 腺细胞受感染的比率越大，说明MBV的感染程度越重.
7.2在荧光显微镜下可见到在浅绿色的背景中，核型多角体型包涵体呈明亮的黄绿色荧光.
7.3诊断结果可疑时，补充PCR检测进行结果确认.
