ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7203.1-2007 对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程 第1部分：PCR检测法 DiagnosticProtocols for HepatopancreaticParvovirus Disease ofPenaeidShrimp- Part1:PCRMethod 2007-06-14发布 2007-09-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T 7203.1-2007 前言 SC/T7203《对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程》分为三个部分： 第1部分：PCR检测法； 一第2部分：组织病理学诊断法； 第3部分：新鲜组织的T-E染色法.
本部分为SC/T7203的第1部分.
本部分的附录A为资料性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站.
本部分主要起草人：黄使、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦.
SC/T 7203.1-2007 对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程 第1部分：PCR检测法 1警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出可能的安全问题.
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件.
2范围 SC/T7203的本部分规定了对虾肝胰腺细小病毒病PCR检测法的原理、试剂与材料、仪器设备、操 作步骤和结果判定.
本部分适用于对虾活体、冰鲜虾产品及其粪便和敏感宿主等样品中肝胰腺细小病毒（hepatopancre- aticParvovirus，HPV)带毒情况的定性检测.
不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评 估.
3规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.2-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法 SC/T7203.2-2007对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法 4原理 4.1对虾肝胰腺细小病毒病的病原和病理学特征 见SC/T7203.2-2007（对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法）中3.1 的规定.
4.2技术原理 按照SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中4.2的规定.
5试剂和材料 5.1所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外按照SC/T7202.2-2007（班节对虾杆状病毒病诊断 规程第2部分：PCR检测法）中第5章的规定.
5.210μmol/L引物F1:5'-GGT-GAT-GTG-GAG-GAG-AGA-3'，-20C保存.
5.310yumol/L引I物R1:5′-GTA-ACT-ATC-GCC-GCC-AAC-3'，-20℃保存.
5.4阳性对照为已知HPV阳性的组织或粪便样品的DNA模板，-20C保存.
5.5阴性对照为已知HPV阴性的组织或粪便样品的DNA模板，-20C保存.
6仪器和设备 所需仪器设备按照SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法） 中第6章的规定.
SC/T 7203.1-2007 7操作步骤 7.1反应体系的准备 7.1.1PCR反应可选择25pL、50gL或100L反应体系进行.
7.1.2在PCR前区按表1的要求，加人除Tag酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物.
按10份/ 支或100份/支分装，保存于-20℃.
在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加人相应 体积的Taq酶，混匀，即成完全的反应预混物.
按1份/支分装到0.2mLPCR管中.
如果PCR仪不具 备热盖功能，再向各管内加人50uL液体石蜡.
暂存于4C.
表1100份PCR反应预混物所需试剂组成 试剂 25L体系 50pL体系 100gL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液（无Mg²*） 250L 500 μL 1 000 L 1x MgCl (25 mmol/L) 400 μL 800 μL 1600 μL 4.0 mol/L dNTP(10 mmol/L) 50 μL 100 μL 200 μL 200 μmol/L 10 ymol/L引物 F1 250 μL 500 μL 1000 μL 1 ol/L 10 mol/L引物 R1 250μL 500μL 1000 μL 1ol/L 灭菌双蒸水 1175 pL 2 350 μ 4 700 TeqDNA聚合酯（5U/μL) 25 p 50 μL 100 μL 0.05U/L 100份反应总体积 2 400 μL 4 800 μL 9 600 pL 注：25pL体系模板量1gL/反应管：50gL体系模板量2L/反应管；100gL体系模板量4L/反应管.
7.2样品准备 按照SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.2的规 定执行.
7.3DNA的提取 按照SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.3的规 定执行.
7.4PCR扩增 7.4.1在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有1份反应预混物的PCR 管帽，分别加人相应体积的样品DNA提取液.
并设阳性对照、阴性对照和空白对照.
7.4.2将上述加有样品模板的PCR管带人PCR后区，置于已预热到94C的PCR仪中保温5min，逐 只依次快速取出并在手掌型离心机上短暂离心1s～2s，使管盖上的样品模板混人反应预混物中，再立 1min，40个循环；72C延伸7min，最后4C保温.
准备进行产物的电泳.
7.5PCR产物电泳 按SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.5~7.1.8 的规定执行.
8结果判定 8.1阳性对照在628碱基对（bp）处会有一条特定条带出现；阳性样品在628bp处会有特定条带出现； 阴性对照和阴性样品在628bp处应无条带出现，空白对照不出现任何条带.
阳性对照在628bp处无特 2
SC/T 7203.1-2007 定条带出现或阴性对照在628bp处有条带出现都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取 样检测.
对虾肝胰腺细小病毒病PCR检测产物序列参见附录A.
8.2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少.
8.3阳性结果表明被检样品中存在HIPVDNA.
对活虾和敏感宿主而言，提示已受HPV感染；对冰鲜 或冰冻对虾而言，提示曾受到HPV感染.
8.4电泳结果的分析和问题排除方法见表2.
表2电泳结果分析 实验结果 结果判读及原因分析 问题排除 对虾样品 阳性对照和阳性样品在628bp处有条带， 1.PCR反应正常，结果有效 阴性对照和空白对照无628bp条带 阳性对照有条带，但分子量标准没有影像 1.分子量标准失效或加样量太 少 更换分子量标准或增加其加样量 1.PCR反应失败 检查并更换PCR反应所用试剂以及 分子量标准有影像，但阳性对照无条带 PCR程序是否正确 2.阳性对照失效 更换阳性对照，重新实验 1.微量移液器污染 清洗微量移液器，只能用PCR后区的 微量移液器取反应产物 2.试剂污染 更换试剂 清洁实验室及所用仪器设备见SC/T 阴性对照或空白对照在628bp处有条带出 3.环境污染 7202.2-2007（班节对虾杆状病毒病诊 断规程第2部分：PCR检测法）附录B 4.操作污染 禁止从PCR后区到PCR前区的交流， 加强操作隔离 1.DNA提取失败或降解 检查提取DNA所用试剂情况，重新实 阳性对照和阴性对照组正常，但已知带毒样 验，确认样品新鲜程度 品无条带 2.DNA浓度过高 将样品稀释10倍以上 3.PCR抑制物介人 稀释样品10倍以上，或重新提取DNA 1.未注意热启动操作，使PCR 做好热启动操作.
样品先要加到PCR 出现非特异性扩增 管盖上，反应预混物预热后，短暂离心（1 s~2s）以混人样品，迅速放回预热PCR 分子量标准正常，但阳性对照、阴性对照和 仪中 样品出现较多杂带或明显的弥散区 2.酶活性、dNTP浓度或Mg 确认预混物制备的准确性、试剂质量， 浓度差异 对不同批次的酶重新测定最佳Mg²离 子浓度 3.温度控制异常 检查PCR仪是否复性温度过低 1.紫外观察仪故障 检查紫外观察仪 2.背景发红太亮 减少EBF°用量，将琼脂糖凝胶置于清 凝胶上无任何影像，包括DNA分子量标准 水中30min后再观察结果 3.凝胶太厚 重新制作琼脂糖凝胶片 4.电极颠倒或电泳时间过长 改正电极方向，重新加样电泳 5.澳化乙锭（EB）分解失效 重新配制澳化乙锭（EB） a澳化乙锭（EB）有毒，试剂的操作和废弃物的处理按SC/T7202.2-2007（班节对虾杆状病毒病诊断规程第2部 分：PCR检测法）附录B的规定执行.
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