ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7204.3-2007 对虾桃拉综合征诊断规程 第3部分：RT-PCR检测法 DiagnosticProtocols for Taura Syndrome ofPenaeid Shrimp- Part3:RT-PCRMethod 2007-06-14发布 2007-09-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T7204.3-2007 前言 SC/T7204《对虾桃拉综合征诊断规程》分为四个部分： 一第1部分：外观症状诊断法； 第2部分：组织病理学诊断法； 第3部分：RT-PCR检测法； 一第4部分：指示生物检测法.
本部分为SC/T7204的第3部分.
本部分的附录A和附录B为规范性附录，附录C为资料性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站.
本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦.
SC/T 7204.3-2007 对虾桃拉综合征诊断规程 第3部分：RT-PCR检测法 1警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出可能的安全问题.
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件.
2范围 SC/T7204的本部分规定了对虾桃拉综合征RT-PCR检测法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作 步骤和结果判定.
本部分适用于对虾的各生活期、非对虾的生物和底泥等样品中TSV带毒情况的定性检测、病原筛 查和疾病的确诊.
不适于对病毒量、存在状态（站污、携带和感染状态）或感染活性等的估测以及宿主感 染程度的评估.
3规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法 SC/T7202.2-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法 SC/T7204.2-2007对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法 4原理 4.1桃拉综合征的病原和病理学特征 见SC/T7204.2-2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法）3.1中的规定.
4.2技术原理 逆转录聚合酶链式反应（Reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）是先利用依赖于 RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA；再以逆转录后的一段DNA作为模板，以模板DNA 两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖于 DNA的DNA聚合酶的催化作用.
经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之 间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而可揭示微 量病毒RNA的存在.
5试剂和材料 5.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸缩水或去离子水或相当纯度的水.
5.2焦乙酸二乙酯（DEPC）：生化试剂.
5.3TRIzolM试剂：生化试剂.
注：可采用相同功效的产品代替.
5.4氯仿.
SC/T 7204.3-2007 5.5异丙醇，新开瓶后立即按附录B的要求用无RNA酶的1.5mL微量离心管分装，1mL/支.
5.61kbDNA分子量标准：生化试剂.
5.7液体石蜡.
5.8澳化乙锭（EB)：生化试剂.
5.9琼脂糖：电泳级.
5.10dNTP（10mmol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物，-20℃保 存.
5.11RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin，32U/gL)：生化试剂，-20C保存.
5.125×EZ缓冲液：生化试剂，含25mmol/LN-二羟乙基甘氨酸，57.5mmol/L醋酸钾，40%甘油， pH8.2，-20℃保存.
5.13rTthDNA聚合酶（5U/uL）：生化试剂，-20C保存.
5.14醋酸锰（25mmol/L）：生化试剂，无RNA酶.
5.15MMLV逆转录酶（200U/uL)：生化试剂，-20C保存.
5.165×MMLV逆转录酶缓冲液：生化试剂，-20C保存.
5.1710×PCR缓冲液：生化试剂，-20℃保存.
5.18MgCl（25mmol/L)：生化试剂，-20℃保存.
5.19TaqDNA聚合酶（5U/uL）：生化试剂，-20C保存.
5.20无RNA酶的水按附录A的规定执行.
5.21无RNA酶的70%乙醇按附录A的规定执行.
5.221×电泳缓冲液按SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测 法）附录A的规定执行.
5.236×载样缓冲液按SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测 法）附录A的规定执行.
5.2410mg/mL澳化乙锭（EB）贮存液按SC/T7202.2-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2 部分：PCR检测法）附录A的规定执行.
5.2510μmol/L引物F1：5'-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3'，用无RNA酶的水配制，-20C保存.
5.2610μmol/L引物R1:5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3'，用无RNA酶的水配制，-20℃保 存.
5.27阳性对照为已知受TSV感染且RT-PCR结果显示明显阳性的样品RNA模板，-70C保存.
5.28阳性对照为已知未受TSV感染且RT-PCR结果显示阴性的对虾组织RNA模板，-70C保存.
5.29空白对照为无RNA酶的水模板.
6设备与用品 6.1PCR仪.
6.2电泳仪：输出直流电压0V~600V.
6.3水平电泳槽.
6.4紫外观察仪或凝胶成像仪.
6.5台式高速离心机：最高转速可达12000r/min以上.
6.6水浴锅.
6.7普通冰箱：具冷藏箱，-18℃以下冷冻箱体.
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SC/T7204.3-2007 6.8超低温冷藏设备：-80℃.
6.9电炉或微波炉等其他加热设备：可满足10mL~50mL液体在250mL三角烧瓶中加热20min.
6.10微量移液器：量程0.5pL~10gL、5L~40gL、40gL~200uL、200gL~1000L.
6.11无RNA酶的微量移液枪头：市售或按附录B的规定执行.
6.12无RNA酶的1.5mL微量离心管：市售或按附录B的规定执行.
6.13无RNA酶的0.2mLPCR管：市售或按附录B的规定执行.
7操作步骤 7.1反应体系的准备 7.1.1根据条件可选用单管法RT-PCR或两步法RT-PCR进行操作.
RT-PCR的反应体系可选择25 μL、50 μL 或100 μL 7.1.2单管法RT-PCR反应体系 7.1.2.1在PCR前区按表1的要求，加人除rTthDNA聚合酶以外的各项试剂，配制成单管法RT- PCR的无酶反应预混物.
按10份/支或100份/支分装，保存于-20C.
在临用前，根据所需的反应份 数，取出无酶反应预混物，加人相应体积的rTthDNA聚合酶，混匀，即成完全的反应预混物.
按1份/ 支分装到无RNA酶的0.2mLPCR管中.
如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加人50L液体石 蜡.
暂存于4℃.
7.1.3两步法RT-PCR反应体系 7.1.3.1PCR反应体系：在PCR前区按照表2的要求，加人除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，配制 成单管法RT-PCR中PCR的无酶反应预混物.
按10份/支或100份/支分装，保存于-20C.
在临用 前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加人相应体积的TagDNA聚合酶，混匀，即成完全的反 应预混物.
按1份/支分装到0.2mLPCR管中.
如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加人50L 液体石蜡.
暂存于4℃.
7.1.3.2逆转录样品预混物：在PCR前区配制100份逆转录样品预混物，向无RNA酶的1.5mL微量 离心管内加人700gL无RNA酶的水、300pL5×MMLV逆转录酶缓冲液、200L10μmol/L引物R1， 总体积1200gL，混匀后，分装为10份/支（120gL/支），保存于-20℃.
7.1.3.3逆转录酶预混物：临用前，在PCR前区根据待测样品和各种对照样品的数量，配制所需的逆 转录酶预混物.
10份逆转录酶预混物（100pL）的配制方法为：22pL无RNA酶的水、20pL5×MMLV 逆转录酶缓冲液、6pLRNasin(32U/pL)、50gL 10mmol/L dNTP、2pL MMLV逆转录酶（200 U/μL).
将所需试剂依次加人无RNA酶的1.5mL微量离心管内混匀后，稍离心，暂存于4C待用.
7.2样品的准备 7.2.1样品采集按SC/T7202.1-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查 法）附录B的规定执行.
7.2.2对虾样品按不同的大小或感染期取不同组织样品0.1g左右.
其中，对虾幼体、仔虾取完整个 体，3cm以下的幼虾取摘除虾眼的头胸部，较大的幼虾可取鳃区或数根鳃丝，成虾取1～2根鳃丝或自 心脏或腹部血窦抽取血淋巴，怀疑为慢性期感染的较大幼虾或成虾取对虾的淋巴器官.
非对虾的甲壳 类动物参照对虾的方法取样.
非生物样品取0.1g~0.5g 7.2.3所取样品分别置于1.5mL无菌微量离心管中，立即进行RNA提取操作或加人0.5mL~1mL TRIzolM试剂，充分研磨后，暂时保存于-20℃.
7.3RNA模板的提取 7.3.1RNA操作的要求按附录B的规定执行.
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