ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7204.4--2007 对虾桃拉综合征诊断规程 第4部分：指示生物检测法 Diagnostic Protocols for Taura Syndrome of Penaeid Shrimp- Part4:Bioassay Method 2007-06-14发布 2007-09-01实施 ；中华人民共和国农业部发布
SC/T 7204.4-2007 前言 SC/T7204《对虾桃拉综合征诊断规程》分为四个部分： 一第1部分：外观症状诊断法； 第2部分：组织病理学诊断法； 第3部分：RT-PCR检测法； 第4部分：指示生物检测法.
本部分为SC/T7204的第4部分.
本部分的附录A和附录B为规范性附录.
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站.
本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦.
SC/T 7204.4-2007 对虾桃拉综合征诊断规程 第4部分：指示生物检测法 1范围 SC/T7204的本部分规定了对虾桃拉综合征指示生物检测法的原理试剂与材料、仪器设备、操作步 骤和结果判定.
本部分适用于通过外部症状检查、RT-PCR检测或组织病理诊断查出为桃拉综合征阳性的样品进 行病毒感染活性的检测或对怀疑患桃拉综合征的动物或携带TSV的其它材料进行病毒的感染活性检 测.
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.
凡是注日期的引用文件，其随后 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法 SC/T7202.3一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法 3原理 3.1桃拉综合征的病原和病理学特征 见SC/T7204.2-2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法）第3.1条的规 定.
3.2技术原理 以健康活泼或无特定病原的凡纳滨对虾（Litopenaeuswannamei）幼虾作为病毒感染的指示生物，采 用经口投喂或注射接种的方法，观察指示生物的发病和死亡情况，并借助组织病理学诊断法对指示生物 进行确诊，从而判定待检样品中TSV的感染能力.
4试剂和材料 4.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.
4.2含氯消毒剂：医用消毒剂.
4.3TN缓冲液按附录A的规定执行.
4.42%无菌盐水按附录A的规定执行.
第3部分：组织病理学诊断法）附录A的规定执行.
4.6人工海水，盐度20～30.
4.7指示虾为健康活泼的凡纳滨对虾（L.camnamei）的幼虾，体重1g～7g，经病理检查诊断为未患白 斑病和桃拉综合征，且不存在其他明显病理症状的健康对虾群体.
4.8碎冰.
SC/T 7204.4--2007 5仪器设备 5.1匀浆器转速达10000r/min以上，推荐采用外套固定，内刀旋转的保护性剪切匀浆刀具.
5.2高速冷冻离心机，转速可达12000r/min以上，离心温度为4℃.
5.3超速冷冻离心机，转速可达30000r/min以上，离心温度为4℃.
5.4普通冰柜或冰箱，具冷藏箱，并带-18℃以下冷冻箱体.
5.5超低温冰箱，-80℃.
5.6不锈钢切刀.
5.7塑料或木制垫板.
5.8一次性乳胶或塑料手套.
5.9不锈钢药匙.
5.101.5mL灭菌塑料离心管.
5.11注射器体积10mL.
5.121mL微量注射器.
5.130.45μm除菌滤器.
5.14无菌试管和烧杯等.
5.15水族箱，容积120L以上，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒30min，再用自来水 5.16控温仪，控温范围10℃~35℃，控温精度±1℃以内.
5.17充气泵.
5.18气石，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以上.
5.19充气管，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以上.
5.20虹吸管，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以上.
5.21表面温度计，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以上.
6操作步骤 6.1材料物品处理 感染性污染的废水、对虾和其他感染性污染的材料和物品的处理按附录B的规定执行.
6.2样品保存 待诊断样品推荐采用活体取样方法，死后动物、非敏感宿主或非生物样品在室温下保存不超过6h、 4C保存不超过48h、-20℃保存数周以内、-80℃保存数月或数年以内.
6.3指示虾的暂养 6.3.1每10尾指示虾为1组，暂养在盐度为20~30的消毒海水中，水体100L～500L，保持充气，温 度控制在22℃～28℃，夜温差≤2℃，分2次投吸适量配合饲料，每天吸污，并换水1/3~2/3.
6.3.2指示虾在室内暂养3d以上，稳定存活后可用于口服投喂或注射接种法感染.
6.4口服法感染 6.4.1口服法感染适用于较小的指示虾.
6.4.2将10g~50g待测对虾样品切成1mm~5mm大小的碎块，按5g/包分装于小塑料袋中，保存 于-20℃（数周）或-80℃（数月至数年）.
6.4.3对照组指示虾始终投喂正常配合饲料；检测组指示虾前三天每天投喂5g～10g切碎的样品，3d 2
SC/T7204.4-2007 后投吸正常配合饲料.
若投喂的病料或配合饲料明显过剩，则减少投吸量.
按原暂养条件暂养观察到 全部动物死亡或首次投吸感染的第14d为止.
各组虹吸管及其他用具需分组消毒或隔离使用.
6.5注射接种法感染 6.5.1注射接种法适用于较大的指示虾.
6.5.2待测样品的准备 6.5.2.1血淋巴样品可用TN缓冲液稀释到1/10~1/20，用0.45um除菌滤器过滤除菌，不需进一步 处理就可用来注射指示虾.
6.5.2.2怀疑感染TSV的虾头或对虾个体的样品需进行匀浆及抽提，如果待测样品处于急性期可使 用全虾；如果待测样品处于慢性期或无症状状态应使用虾头.
取5g~10g虾头或对虾个体样品，去除 甲壳，按1：2~1:3的比例在其中加人TN缓冲液或2%无菌盐水.
用匀浆器将上述样品对虾匀浆.
为 防止样品过热，在整个操作过程中要把盛组织和匀浆液的容器置于碎冰中保持冷却.
6.5.2.3其他可能携带TSV的样品取30g~100g，按1:2~1:3的比例加人TN缓冲液或2%无菌盐 水匀浆.
6.5.2.44℃下3000r/min离心10min以澄清匀浆液.
弃沉淀，保留上清液.
6.5.2.5上清液再于10000r/min在4C离心30min～50min.
弃沉淀，保留上清液.
6.5.2.6如果待检样品病毒含量可能较低，或上清液体积过大（≥100mL)，可将上清液在60000r/ min于4C离心2h，弃上清液，在沉淀中加人5倍体积的2%无菌盐水，用滴管吹打悬浮混匀，再于10 000r/min离心10min，保留上清液.
6.5.2.7用2%无菌盐水将上一步骤得到的上清液稀释到1/10和1/100.
6.5.2.8用5mL注射器和0.45um除菌滤器过滤上一步骤中稀释的上清液.
用无菌试管或烧杯收集 6.5.2.9滤液分装于1.5mL灭菌塑料离心管中，可保存在-20C（保存数周）、-80℃（长期保存几个 月到几年）或立即用来注射指示虾.
6.5.3注射接种方法 6.5.3.1用1mL微量注射器将6.5.1中准备好的样品液注射接种暂养的指示虾，每克虾体重注射 0.01 mLo 用同样体积的2%无菌盐水作为对照注射1组指示虾，对照组的注射应在注射样品组之前完成.
6.5.3.2从指示虾的第三腹节处向前进针，肌肉注射到指示虾的体内.
6.5.3.3注射接种后将指示虾按原暂养条件分组暂养监测，至指示虾死亡或注射后第七天为止.
6.6感染结果诊断 激死对虾和最后幸存的检测组和对照组的全部指示虾样品用戴维森氏AFA（Davidson'sAFA)固定 液按SC/T7202.1-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法）附录B规定 的方法固定，并按SC/T7204.2-2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法）规 定的方法进行病理学诊断.
7结果判断 7.1结果判定的首要依据 7.1.1对照组的指示虾应该不出现任何桃拉综合征或其他疾病的病症，组织病理学诊断结果应该 正常.
否则本次检测结果无效，需要分析对照组发生感染的原因，然后再重新选取指示虾并重新进行检 测试验.
7.1.2检测组发病和死亡的指示虾只有符合SC/T7204.2-2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2 3
