ICS 11.220 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7214.1-2011 鱼类爱德华氏菌检测方法 第1部分：迟缓爱德华氏菌 DetectionmethodsforEdwardsiellafromfish- Part1:Edwardsiella tarda 2011-09-01发布 2011-12-01实施 中华人民共和国农业部发布
SC/T 7214.1-2011 前言 SC/T7214-2011《鱼类爱德华氏菌检测方法》分为3部分： 第1部分：迟缓爱德华氏菌； 一第2部分：爱德华氏菌； 第3部分：保科爱德华氏菌.
本部分为SC/T7214-2011的第1部分.
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
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本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出.
本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口.
本部分起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所.
本部分主要起草人：赵飞、姜兰、邹为民、谭爱萍、陆小苔、罗理、王伟利.
SC/T 7214. 1-2011 鱼类爱德华氏菌检测方法 第1部分：迟缓爱德华氏菌 1范围 本部分规定了鱼类迟缓爱德华氏菌的采样程序、细菌鉴定方法与结果判定指标.
本部分适用于鱼类迟缓爱德华氏菌的检测.
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GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T7014-2006水生动物检疫实验技术规范 3试剂、染色液与培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按GB/T4789.28、GB/T18652或SC/T7014中的规定 执行；聚合酶链式反应（PCR）测定用水应符合GB/T6682中一级水的规格，且要用焦炭酸二乙酯 （DEPC）处理水（A.1），上述未提及的见附录A.
16SrRNA基因DNA序列扩增引物，P1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P2：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-20C保存.
4设备和器械 超净工作台、生物显微镜、PCR仪、电泳仪、微生物检测必备辅助设备和器械等.
5细菌分离与培养 5.1取样 取鱼的肝、肾及病灶组织.
从取样组织中直接分离接种；在无菌环境中将样品置于无菌离心管中，用无菌盐水冲洗并捣碎，然 后分离接种. 5.2分离培养 样品接种在血液琼脂平板（按GB/T4789.28-2003中4.6规定的方法配制），按常规法划线.
28℃培养24h~48h.
然后，从中挑取灰白色、圆形、湿润、是半透明状的单菌落在普通营养琼脂平板 （按GB/T4789.28-2003中4.7规定的方法配制）进行纯化培养.
6革兰氏染色 按GB/T4789.28-2003中2.2的规定执行.
SC/T 7214. 1-2011 7生理生化试验 7.1硫化氢试验 按GB/T4789.28一2003中3.14的规定执行.
培养基变黑色为阳性，不变黑色为阴性.
7.2运动性试验 半固体琼脂按GB/T4789.28-2003中4.30的方法配制.
把待检菌穿刺接种于半固体琼脂，28℃ 培养24h.
若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若待检菌只生长在穿刺线 上，边缘十分清晰，为运动性阴性.
7.3氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对苯二胺的1%水溶液滴在细菌的菌落上.
菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性， 不变色为阴性.
7.4丙二酸盐利用试验 按GB/T4789.28一2003中3.7的规定执行.
培养基由绿色变为蓝色为阳性，不变蓝色为阴性.
7.5刚哚试验 按SC/T7014-2006表2的吲噪（靛基质）试验的规定执行.培养基变红色为阳性，不变红色为阴 性.
7.6甲基红（M.R）试验 按SC/T7014-2006表2的甲基红（M.R）试验的规定执行.
培养基变红色为阳性，不变红色为阴 性.
7.7赖氨酸脱羧酶试验 按GB/T4789.28-2003中3.12的规定执行.试验管培养基呈紫色、对照管培养基呈黄色为阳 性，试验管培养基不呈紫色、对照管培养基呈黄色为阴性.
7.8β-半乳糖苷酶（ONPG）试验 按GB/T4789.28-2003中3.3的规定执行.
培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性.
7.9糖、醇类（D-葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-甘露醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（配制方法见A.2)，28℃C培养24h后观察.
培养基 变黄色为阳性，不变黄色为阴性.
816SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析试验 8.1DNA提取 8.1.1将5.2分离纯化的待检菌接种于普通营养液体培养基中，以28℃摇床培养24h.
8.1.2取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体.
10pL20mg/mL的蛋白酶K（A.5），混与，37℃温育1h.
8.1.4加人100gL5mol/L的NaCI溶液（A.6），充分混匀，再加人100LCTAB/NaCI溶液（A.7)， 混匀，65℃温育20min.
8.1.5加人等体积的酚氯仿：异戊醇（25：24：1）（A.8），混匀，12000r/min离心5min.
8.1.6取上清液加人等体积的氯仿：异戊醇（24：1)（A.9），混匀.12000r/min离心5min.
8.1.7取上清液，加人1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，10000r/min离心10min：沉淀 用70%酒精洗涤2次，室温晾干.
8.1.8加人50uL的TE缓冲液溶解，-20C贮存，备用.
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SC/T 7214. 1-2011 8.216SrRNA基因DNA序列扩增 8.2.1在PCR管中加 10×PCR缓冲液（无Mg²）5.0uL，MgCl（25mmol/L）5.0μL，dNTPs (10 mmol/L)1. 0 μL 引物(20 μmol/L)P1 和 P2各 1. 0 μL Taq DNA 酶(5 U/ μL)0.5 pL DNA 模板 1.0uL，无菌双蒸水35.5pL.
设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板.
如果使用无 热盖的PCR扩增仪，需在反应混合物上覆加2滴矿物油.
混匀后，3000r/min离心30s.
8.2.2将反应管置于PCR扩增仪，按下列程序进行PCR扩增：94C预变性2min；94C变性45s 52℃ 退火1min，72C延伸1min，35次循环：72C延伸7min；4C保温.
8.3琼脂糖凝胶电泳 板，凝固后放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面.
将上述6pL样品和2pL澳酚蓝指示剂溶液 （A.11）加人样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照.
8.3.2120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止.
于紫外光下观察电泳条带的数量和位置.
8.3.3在长波紫外灯下用刀片切下含有目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重， 8.4PCR扩增产物纯化、测序及序列比对 8.4.1PCR扩增产物纯化 8.4.1.1按每0.1g琼脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加人8.3.3含有目的条带胶块的离心管中.
8.4.1.2经激涡混匀器振荡1min~2min，将离心管在-70C放置1h，使凝胶完全冻结.
8.4.1.337C水浴将冻结的凝胶融化后，在激涡混匀器上振荡1min~2min：14000r/min离心5min.
8.4.1.4取上层水相转人另一离心管中，加人等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)（A.8），混匀， 12 000r/min离心5min.
8.4.1.5取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1)（A.9），混匀，12000r/min离心5min.
8.4.1.6向收集的水溶液中加人1/10体积的3mol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置一20℃过 夜或-70C放置1h~2h.
8.4.1.714000r/min离心10min，弃上清.
8.4.1.8将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液中，置一20C保存，待测.
8.4.2将8.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析.
9结果判定 9.1菌落形态 28℃珞养24h~48h，形成圆形、隆起、灰白色、湿润并带有光泽、呈半透明状的菌落.
9.2细菌染色 革兰氏染色为阴性.
9.3生理生化反应试验 生理生化反应试验见表1.
表 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 硫化氢 运动性 氧化酯 内二酸盐利用 引噪 甲基红 1 赖氨酸脱胶酶 D-葡萄糖 燕糖 L-阿拉伯糖 " 海藻糖 D-甘露醇
