ICS 65. 020. 20 B 61 中华人民共和国林业行业标准 LY/T3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 TechnicalregulationforwillowvarietiesidentificationbySSRmarkers （发布稿） 2019-10-23发布 2020-04-01实施 国家林业和草原局 发布
LY/T3107--2019 前言 本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草.
本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）提出并归口.
本标准主要起草单位：南京林业大学.
本标准参加起草单位：江苏省林业科学研究院：山东省林业科学研究院.
本标准主要起草人：李淑斓、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东.
LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 范围 本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料，利用微卫星标记（microsatellite)对国家和省审(认)定 的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术.
本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别.
2术语和定义 2.1微卫星标记microsatellite 微卫星标记，又被称为短串联重复序列(shortandem repeats STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，简称SSR)，是指基因组中由2~6个核苷酸组成的DNA串联重复序列.
2.2基因型频率 genotype frequency 基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型赖率的总和为1或100%.
3操作程序 3.1取样和保存 取柳树幼嫩叶片5片～10片，用干燥硅胶密封保存，用于DNA提取.
3.2DNA提取所需试剂 a)1MTris：称取12.11gTris 溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL.
b)0.5MEDTA：称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL.
c)5M氯化钠：称取23.38g氯化钠溶储到80mL.超纯水中，定容到100mL.
d)5M醋酸钾：称取25.54g醋酸钾，200mL超纯水溶解后定容到250mL.
e)2%SDS：称取1.0g十二烷基硫酸钠（SDS)，40mL超纯水溶解后定容到50mL.
f)10%CTAB：称取10gCTAB（十六烷基三甲基溴化铵）溶解到80mL超纯水中，定容到100mL.
g)氯仿异戊醇：240mL氯仿，10mL异戊醇混合.
h)70%乙醇：70mL乙醇，加入30mL超纯水.
i) CTAB 裂解液: 1 mL 1 M Tris(pH=8.0) 4 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0) 28 mL 5 M 氯化钠 10 mL 10% CTAB，5g聚乙烯吡咯烷酮，定容到100mL.
ji)TBE缓冲液（10x：称取108gTris 碱和55g硼酸，加入40mL0.5 M EDTA溶液（pH=8.0），用
LY/T 3107-2019 800mL双蒸水溶解后定容到1L，高温灭菌.
3.3DNA提取 DNA提取采用改良的CTAB法： a)向 2mL 离心管中加入400 μL CTAB裂解液，10μL的10mg/mL Rnase，2μLβ-疏基乙醇.
b)取柳树叶片3-5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中， 涡旋混匀后，65℃保温10min，再加入400μL2%SDS，涡旋混匀，65℃保温10min.
c)向3.2.2的离心管中加入130μL5M醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存10min.
d)加入800μL氯仿异戊醇溶液（氯仿：异戊醇=24:1），涡旋混匀后，12000rpm离心5min.
e)将上清液转移到新的2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管8-10次，-20℃冻 存20min.
f)取出离心管，12000rpm离心5min，去除上清液.
g)加入500μL的70%乙醇，1200rpm离心2min，去除上清液.
h)重复3.2.7步骤一次.
i）加入500μL无水乙醇，12000rpm离心5min，去除上清液，离心管开盖室温放置30min.
j)）加入100μLTE缓冲液，37C保存5min，涡旋混匀获得DNA，将样品放在-80C长期保存.
3.4DNA定量及质量检测 a)取2μLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出DNA浓度和A260/280的比值.
b)根据上述测定浓度，取200ngDNA，加入2μL溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入5000 bpmarker作对照，稳压100V，电泳缓冲液为1xTBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照.
c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成20ng/μL，在-20℃下保存备用.
3.5目的片段PCR扩增 3.5.116对SSR引物及序列见附录B.
3.5.2目的片段扩增反应体系为15L，具体试剂用量见表1.
表1PCR扩增反应体系 试剂 浓度 所需体机4） PCR buffer 10×PCR buffer(Mg* Plus) ST Taq酶 5 Uμ 0.2 Forward Primer 5mM 1 Revere Primer 5mM 1 DNA 20 ng/μL 2 dNTP 5mM 0.3 dUTP 250 nM 1
LY/T 3107-2019 H;O 6.8 3.5.3PCR扩增反应 将配制的扩增体系加入到8连管或96孔PCR板中，盖上管盖后涡旋混匀，在3000rpm下离心5s， 放入PCR仪中扩增，扩增程序为： 1) 94“C变性4min； 2)94C变性30s，55“C退火30s，72C延伸1min，共35个循环； 3)72C延伸10min，15℃保存.
3.6目的片段检测 3.6.1PCR产物变性 9%内标Genescan500Rox）后混匀：在PCR仪上运行变性程序：95C变性5min，迅速放冰上冷却.
3.6.2PCR扩增产物检测 PCR产物检测采用ABIPRISM3130x分析系统.
从数据采集软件中创建一个片段分析程序，选择 片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型.
创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类 型、内标类型、分析方法等.
将变性的产物转入96孔PCR板，盖上仪器自带的PCR板盖，放入仪器 中.
在软件中将PCR板链接到仪器，点击开始进行基因型分型.
3.6.3PCR扩增产物条带分析 采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小.
4送检样品分析 送检样品分析程序为： a)随机选取附录B.1中的一对SSR引物，对待检样品进行PCR扩增.
b)将待检样品扩增得到的条带和附录C.1-C.2中对应引物的标准谱带相比较.
种：如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯 一匹配的品种.
d)如果待检样品扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种.
e）根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，见附录D.
