ICS 65. 020 B 60 中华人民共和国林业行业标准 LY/T3191-2020 林木DNA条形码构建技术规程 Technical regulations of DNA barcodes in woody species 2020-03-30发布 2020-10-01实施 国家林业和草原局 发布
LY/T3191-2020 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家林业和草原局提出.
本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）会归口.
本标准起草单位：中国林业科学研究院热带林业研究所，湖南省林业科学院，中国科学院华南植物 园，中国科学院植物研究所，江西农业大学林学院.
本标准主要起草人：装男才、梁军生、陈步峰、葛学军、米湘成、刘娟.
LY/T 3191-2020 林木DNA条形码构建技术规程 1范围 本标准规定了林木DNA条形码构建中样本采集策略、核心DNA条形码片段选取标准、DNA提取 技术和保存、序列测定和编辑方法、系统发育关系构建等技术要求.
本标准适用于林木DNA条形码的构建.
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T4625-2016DNA条形码筛选与质量要求 SN/T4626-2016DNA条形码物种签定操作规程 SN/T4714-2016DNA条形码数据库技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准.
3.1DNA条形码DNAbarcodes 是从线粒体、叶绿体或核基因组区域中筛选的一段短的通用的DNA序列，以期对现存生物在物种 水平上进行快速面准确的识别和鉴定.
3.2引物Primer 是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进 行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链.
3.3聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction（PCR) 一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等儿步反应组成一个 周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点.
3.4 DNA序列 DNA sequence
LY/T 3191-2020 多核苷酸链中的核苷酸的排列顺序.
可能的字母只有A、C、G和T，分别代表组成DNA的四种核苷 酸--腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶：无间隔地排列在一起，例如序列AAAGTCTGAC.
3.5 DNA测/序 DNA sequencing technology 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定，也就是测定组成DNA分子的A、T、G、C的排列顺序.
3.6系统发育关系Phylogeny 生物有机体随着时间变化面呈现的起源、演化历史及其亲缘关系.
3.7简约法系统发育分析Phylogenetic Analysis Using Parsimony(and Other Methods)(PAUP) 一款用于构建进化树（系统发育树）及进行相关检验的软件，包含了众多分子进化模型和方法，可利 用最大似然法、简约法、距离法等分析分子数据(DNA、蛋白质序列)、形态数据及其他类型数据.
3.8系统发育研究赛百平台Cyberinfrastructure for PhylogeneticResearch(CIPRES) 一款为科研机构和研究人员设计和开放的远程超级计算机平台，可满足巨量数据的运行要求，能大 幅节约时间成本，提高运算结果的可靠性.
3.9 分子进化遗传分析软件Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA) 一款操作便捷、功能强大的分子进化遗传分析免费开源软件，可与其他在线公共超算平台互补.
3.10DNA条形码系统发育R包Phylotools 一款可自动进行大规模DNA序列排列和比对的软件，可构建基于多个条形码片段的超级矩阵，获 取群落水平系统发育关系.
经过非参数速率平滑NPRS法（r&s)转换后的进化树，就可以进行相应的群落 系统发育分析.
此外，可根据实际情况增加MAFFT等算法更新、运行速度更快的比对软件，获得更准 确的分析结果.
4样本采集策略 4.1采集部位.
干净的成熟叶片最佳，特殊情况下可采集枝条、树根和树皮韧皮部等材料：避免采 集被虫咬、有病菌的叶片.
4.2样品重量.
阔叶树叶片5-10片，细羽状复叶或针叶树叶片5-10克；足够用于DNA提取.
4.3样品数量.
常见种3-5个来源于不同居群的个体，稀有种尽量多采集：避免样品中出现错误鉴 定的物种.
4.4样品编号.
结合样地中物种号和树牌号进行编号：多个个体时，需作区分：如樟树-1（树牌号）， 樟树-2（树牌号）.详细记录采集时间.
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LY/T3191-2020 4.5样品保存.
直接将材科置于封口袋，在封口袋中倒入干净的硅胶：或将材科放入空茶包中，可 不与硅胶直接接触，确保材料不受污染.
若材料含水量较高，注意及时换新的硅胶，保证材料品质；正 常情况下硅胶颜色深蓝，若吸水较多，硅胶颜色将变为浅紫红，此时需换新的硅胶.
条件允许的情况下， 对一些叶片材料不容易提取DNA的样品可以采用冷藏保存.
4.6凭证标本.
植株整体/局部、大生境/微生境的照片和信息，记录伴生种及经纬度等.
凭证标本 要求带花或果实的枝条：无花或果实时，则用带叶的枝条.
记录树木的标牌号以及与自封口袋上的样品 编号.
每个样点和每个物种采集3份以上凭证标本；采集后当天压制，最后统一交付标本馆保存.
5核心DNA条形码片段选取标准 5.1进化速率.
进化速率较慢的片段可以锚定目标物种到科/属的较高分类等级，化速率较快的片段 则可将近缘类群进行识别和分辨.
5.2分辨能力.
种间有明显的遗传变异，面种内变异足够小：片段所含的变异位点多则分辨力高： 进化速率较快的片段比进化速率较慢的片段有更高分辨力：组合片段比单个片段提供更多的变异位点.
5.3片段长度.
足够短，减少测序工作，且便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对存在DNA降解的材 料（如：保存已久的腊叶标本、处理过的民间药材）：降低测序费用：不同物种间序列长度变异尽可能小.
5.4片段通用性.
存在保守区域，便于设计通用引物.
也可以从已发表的基因组、转录组数据中筛 选合适的DNA片段作为特定物种的条形码.
6DNA提取技术和保存方法 6.1CTAB法.
对少数富含次生代谢物质或油脂的物种（如樟科、桑科植物），在CTAB程序之前增加 冰浴步骤以消除影响.
详见附录1.
6.2试剂盒法.
一般推荐离心柱型，具体操作步骤可在所用试剂盒说明书上获得.
6.3DNA保存方法.
提取出的DNA，经过电泳检测之后，一部分保存在-80C冰柜长期保存备 用，一部分放置在-20℃冰箱中用于后续实验.
