HJ 中华人民共和国国家生态环境标准 HJ1190-2021 水质 灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌 黑色变种） 的鉴定 生物学检测法 Waterquality- -Identification ofbiologicalindicator(Bacillussubtilisvar. niger)for sterilization--Biologicaldetectionmethod 本电子版为正式标准文本，由生态环境部环境标准研究所审校排版.
f 信息服务平 2021-09-17发布 2022-04-01实施 生态环境 部发布
HJ 1190-2021 目次 前言. 1适用范围 2规范性引用文件 3术语和定义， 4方法原理 5试剂和材料 6仪器和设备， 7样品. 8分析步骤， 9结果与报告. 10灵敏性和特异性 11质量保证和质量控制. 12废物处置， 附录A（规范性附录） 培养基和染色液 附录B（规范性附录） 培养基和染色液使用说明及结果观察， 14 a 工 息服务平台
HJ1190-2021 前言 为贯彻《中华人民共和国环境保护法》《中华人民共和国水污染防治法》，防治生态环境污染，改善 生态环境质量，规范水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定方法，制定本标准.
本标准规定了鉴定水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学方法，用于微生物实验 室灭菌效果的评价.
本标准的附录A和附录B为规范性附录.
本标准为首次发布.
en 本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订.
本标准主要起草单位：上海市环境监测中心.
本标准验证单位：浙江省生态环境监测中心、江苏省常州环境监测中心、华东师范大学、上海市松 江区环境监测站、上海市长宁区环境监测站和上海市青浦区环境监测站.
本标准生态环境部2021年9月17日批准.
本标准自2022年4月1日起实施.
本标准由生态环境部解释.
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HJ 1190-2021 水质灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定 生物学检测法 警告：检测人员应采取必要的生物安全防护措施（包括但不仅限于一次性手套、口罩、防护服、防 护眼镜、鞋套等防护用品）；检测时应做好无菌防护，在无菌操作设备内进行.
1适用范围 本标准规定了鉴定水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学方法.
本标准适用于微生物实验室灭菌效果的评价.
2规范性引用文件 E 本标准引用了下列文件或其中的条款.
凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准.
凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本标准.
《消毒技术规范》 （原卫生部卫法监发（2002）282号） 3术语和定义 0 下列术语和定义适用于本标准.
3.1 E 枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus subtilisvar.niger 也称萎缩芽孢杆菌（Bacillusatrophaeus），在含酪氨酸的培养基上形成黑色素的革兰氏阳性芽孢杆 菌.
作为灭菌效果评价试验的指示菌种.
3.2 灭菌sterilization 用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和航病毒蛋白，使之达到无 菌保障水平.
常用的灭菌方法有化学试剂灭菌（如环氧乙烷、甲醛等）、射线灭菌（如y射线、电子束 辐射等）、湿热灭菌、干热灭菌和过滤除菌等.
3.3 生物指示物biologicalindicator 含有对特定灭菌过程具有一定耐受力的活微生物的生物制品.
注：生物指示物为特定灭菌过程是否满足杀灭指定数量微生物的必须条件提供信息，并规定该过程的置信水平.
HJ 1190-2021 4方法原理 经灭菌处置后含枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的水样通过孔径为0.45um的滤膜过滤，细菌和芽孢被 截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36C±1C培养72h~96h，枯草芽孢杆菌黑 色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落.
对特征菌落进行染色镜 检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷 和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性.
5试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为蒸馏水.
5.1酪氨酸琼脂培养基，见附录A1.
5.2营养琼脂培养基，见附录A.2.
5.3淀粉培养基和碘液，见附录A3.
5.4硝酸盐还原培养基和相关试剂，见附录A.4.
5.5甘油复红肉汤培养基，见附录A.5.
5.6甘露糖生化培养基，见附录A6.
5.7甘露醇生化培养基，见附录A.6.
5.8苦杏仁苷生化培养基，见附录A.7.
5.9革兰氏染色液，见附录A8.
5.10芽孢染色液，见附录A.9.
5.11阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）.
5.12阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilisvar.niger）.
5.13枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液：按照《消毒技术规范》2.1.1.2.3（2）的规定制备，也可购买浓 度范围在10°CFU/ml~10CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液.
5.14无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜.
按无菌操作要求包扎，经121C高压蒸汽灭菌20min，晾干备用：或将滤膜放入烧杯中，加入实 验用水，煮沸灭菌3次，15min/次，前2次煮沸后需换水洗涤2~3次.
也可采用市售的无菌滤膜.
5.15石蜡质封口膜.
5.16无菌水：取适量实验用水，经121C高压蒸汽灭菌20min，备用.
注1：5.1~5.10的成分及制备方法见附录A.也可使用市售商品化培养基或染色液： 注2：5.11~5.12，建议购买由国内或国际菌种保藏机构保藏的选传学特性得到确认和保证并可追溯的标准菌株.
6仪器和设备 6.1样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的250ml、500ml广口玻璃瓶.
6.2恒温培养箱：36℃±1℃.
6.3高压蒸汽灭菌器：121C，可调.
6.4pH计：准确到0.1pH单位或更高精度.
也可使用pH精密试纸.
6.5显微镜：物镜4×或5×、10×、20×、40×，油镜100×，目镜10×或15×.
6.6分析天平：实际分度值0.0001g.
6.7培养Ⅲ：直径90mm.
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