BJS 食品补充检验方法 BJS202401 食品中动物源性成分定性检测 2024-12-22发布 国家市场监督管理总局 发布
BJS 202401 食品中动物源性成分定性检测 1范围 本方法规定了食品中动物源性成分的检测方法.
本方法适用于食品中可能含有的一种或者多种哺乳类、禽类、鱼类等动物源性成分的高通量测序定 性检测. 可鉴别动物物种列表见附录A. 本方法检出限为1%（质量分数）.
2原理 针对动物线粒体基因（zDNA）的相对保守片段设计通用PCR引物，将扩增片段与数据库比对，确 定所属动物物种，实现样品中动物源物种成分的定性检测.
3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
试剂均用无 DNA酶污染的容器分装.
3.1引物 引物序列见表1.
表1引物序列 引物类型 引物序列 片段大小 基因名称 上游引物 5′-adapter-GGTAAA WYTYGTGCCAGCCA-3* 20 bp 12S rRNA 下游引物 5′-adapter-GCATAGTGGGGTATCTAATCCYAG-3′ 24 bp 12S rRNA 注：表中含简并碱基其中碱基W代表碱基A/T，碱基Y代表碱基C/T.adapter表示接头为一段短核苷酸序 列用于连接目标测序片段.
3.2试剂 3.2.1 1十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，CHBrN）. 3.2.2 氯化钠（NaCl).
3.2.3 乙二胺四乙酸二钠盐（Na-EDTA，CHNONa）. 3.2.5盐酸（HC1):4mol/L.
3.2.6苯酚（CHO）. 3.2.7三氯甲烷（CHCI）.
BJS 202401 3.2.8异戊醇（C;HO） 3.2.9无水乙醇（CHO） 3.2.10异丙醇（CHO） 3.2.11琼脂糖（CHO，），电泳级.
3.2.12DNA电泳分子量标准品；50 bp~500 bp.
3.2.13蛋白酶K：20 mg/mL. 3.2.14文库集纯化磁珠.
3.2.15PCR扩增预混液：包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、镁离子、dNTP、PCR稳定剂和增强剂.
3.2.16文库构建试剂盒：至少包含连接头、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、缓 冲液.
3.2.17高通量测序试剂盒：至少包含测序引物、高通量测序反应酶、缓冲液.
3.2.182%琼脂糖凝胶：含SYBRSafe染料.
3.3试剂配制 3.3.1 CTAB 裂解液;称取 4.00 g CTAB 16.38 g NaC1 1.50 g Na-EDTA 3.13 g Tris HCl 用适量 水溶解后，调节pH至8.0，定容至200mL.
3.3.2苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1，体积比）：将苯酚、三氯甲烷、异戊醇按25：2411的体积混 合均匀.
3.3.3 TE 缓冲液(Tris HC1 EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris HCI(pH 8 O) 1 mmol/L Na:- EDTA(pH 8.0).
移液器移取 1 mol Tris-HC1(pH 8.0)1 mL 0.5 mol Na -EDTA(pH 8.0)0.2 mL 纯 水定容至100mL. 3.3.470%乙醇（70130，体积比）：将无水乙醇、水按70：30的体积混合均匀.
4仪器和设备 4.1测序仪器 高通量基因测序仪：测序质量Q30（Quality Value，V=30)>95%，序列读长>200bp.
4.2设备 4.2.1组织均质器.
4.2.2电子天平：感量0.01g. 4.2.3高速冷冻离心机：最大转速≥12000r/min. 4.2.4恒温水浴装置，99C士1℃.
4.2.5涡旋混合器.
4.2.6核酸蛋白分析仪，检测范围：0.1ng/ul~100ng/μL.
4.2.7PCR扩增仪，温度范围：0℃C~99℃.
4.2.8电泳仪：最大电压≥200V，最大电流≥300mA 4.2.9凝胶电泳成像仪.
000 1~0000~00~~1001 4.2.11pH计，精度：±0.01 pH（25C）.
4.2.12磁珠纯化仪：处理体积20pL~200μL，磁珠收集效率>99%.
BJS 202401 5分析步骤 5.1试样制备 多点选取适量具有代表性的待检样品共100g进行均质处理，样品处理条件：样品与水的质量比 为1：1，均质至糜状，均质后的样品收集至离心管中进行后续操作，或一20℃以下冻存.
5.2DNA提取 样品DNA溶解：称取均质样品0.1g~0.2g置于2mL离心管中，加人600μLCTAB裂解液和 20gL蛋白酶K，涡旋混匀，恒温浴65C孵育1h~2h，期间每隔10min振荡混匀.
离心 5 min DNA沉淀：小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12000r/min 离心5min，弃上清液.
DNA清洗：用500αL70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，12000r/min离心5min，弃上清液，室温自 然晾干；加人50pL~100uLTE缓冲液或水，溶解DNA，-20C保存备用（1周内使用）.
注：也可用等效DNA提取试剂盒提取DNA 5.3DNA浓度测定 使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度，每个样品重复3次，取平均值.DNA浓度在2ng/pL~100ng/μL 之间，适用于本方法.
5.4基因文库构建 5.4.1 PCR扩增 30μL反应体系：PCR反应预混液15μL，上游引物（10pmol/L，含连接接头引物标签）、下游引 物（10mol/L，含连接接头）各 1.0μL DNA 模板10ng~20ng，用水补足 30μL. 一般反应程序：95C预变性5min：95℃30s.60℃45s.72℃45s，35个循环：72C延伸10min.
需同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照.
以灭菌水为空白对照，以引物和不含目标DNA片段 的模板为阴性对照，以引物和已确定来源的动物源性成分DNA为阳性对照.
样品和对照设置两个平 行的反应体系.
扩增完成后获得两端连有接头（含有与扩增及测序引物互补的序列），中间有短序列标签结构的 DNA文库.
注：也可用等效商品化试剂盒进行扩增.
5.4.2PCR产物凝胶电泳 采用2%琼脂糖凝胶电泳预估每个样品DNA浓度，将每个PCR扩增产物与上样缓冲液等体积混 合后单独上样，上样体积20pL，同时上样分子量标准品（50bp~500bp）.
设定恒定电压200V进行电 泳，直至指示剂迁移至凝胶中部，用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照记录电泳条带的强度.
多个样品 同时测序时，根据目标条带强度将不同样品按比例混合PCR产物（确保浓度范围一致），形成文库集.
注：也可用等效方法预估样品DNA含量.
5.4.3文库集纯化 采用磁珠富集法或等效的纯化方法对文库集进行纯化，磁珠富集法见附录B.
BJS 202401 5.5DNA测序 5.5.1测序文库的制备 经5.4.3纯化后的基因文库集按照5.3定量后，DNA浓度应符合高通量测序仪DNA测序的要求.
采用测序仪匹配的试剂盒与流程，对5.4获得的基因文库进行大规模平行扩增，得到测序文库.
动物源 性成分基因扩增靶标参考序列见附录A，文库制备流程见附录B. 5.5.2测序 按照测序仪对应的标准测序流程进行高通量测序，测序流程见附录C.
6结果判断与表述 6.1质量控制 6.1.1PCR结果质量控制 空白对照和阴性对照无PCR扩增条带，阳性对照扩增产物为215bpDNA片段，否则结果无效.
6.1.2测序质量控制 样品经过高通量测序得到的原始数据，去除含接头或低质量的序列、外源或宿主基因组序列，每个 样品（含相同引物标签）测序生成的可用高质量序列数目应大于0.5×10”条.
通过测序仪器的数 据进行Q20、Q30的统计和评估，每个DNA产物可用数据对应的碱基识别质量值应符合以下要求： 一大于Q20的碱基比例≥90%； 一大于Q30的碱基比例≥80% 注：Q20为 Quality Value 取 V-20 时的数值，Q30为 Quality Value取 V30 时的数值.
6.2序列分析 使用相应的序列比对软件对测序数据进行分析，预处理后的数据在NCBI或其他开放数据库中进 行序列比对，采用数据库中序列一致性大于98%的标签注释待测物种.
也可利用带有相关数据支持的 商品化数据库进行自动结果分析.
注1：NCBI数据库网址.ncbinlm.nih.gov.使用NCBI 数据库手动分析的具体步骤为 NCBI数据库→选择 “BLAST"检索（BLAST）→选择核酸比对（Nucleotide BLAST）→输人要查询的序列，一般小于1 500条/次 （Enter Query Sequence)→设置比对参数：Organism限制为所需物种 如 animals（taxid 33208);Max target sequences 设置为 10→点击“比对”(BLAST).
6.3物种鉴定结果判定 样品序列与数据库标签一致性≥98%，检测结果为一致性最高的物种.
样品序列与数据库标签一致性<98%，则重复试验. 若再次检测后，一致性≥98%，检测结果为一 致性最高的物种，若一致性仍<98%，则该样品不适用本文件方法检测. 样品序列与数据库一致性≥98%，为一致性最高的物种时，其检测结果描述为样品中含有某源性 成分. 7防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行.
