BJS 食品补充检验方法 BJS202410 粉丝中植物源性成分的测定 2024-12-22发布 国家市场监督管理总局 发布
BJS 202410 粉丝中植物源性成分的测定 1范围 本方法规定了粉丝中红薯、绿豆、豌豆、玉米、马铃薯、木薯源性成分检测的实时荧光PCR方法.
本方法适用于粉丝中红薯、绿豆、豌豆、玉米、马铃薯、木薯源性成分的定性检测.
2原理 提取样品DNA，通过特异性引物探针进行植物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反 应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品植物源性成分的定性分析.
3试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂 3.1.1a-淀粉酶（1500U/mg~3000U/mg，U为酶活力单位）.
3.1.2氯化钠（NaCl). 3.1.3十二烷基硫酸钠（SDS.CHSONa）.
3.1.4三羟甲基氨基甲烷（Tris，CHNO） 3.1.5乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA，CHNONa）.
3.1.6盐酸（HC1，体积分数37%）.
3.1.7氢氧化钠（NaOH）.
3.1.8蛋白酶K（20mg/mL，20℃保存）.
3.1.9核糖核酸酶A（RNA酶A). 3.1.10乙酸钾（CHCOOK）.
3.1.11乙酸（CHCOOH）. 3.1.12聚乙二醇20000. 3.1.13无水乙醇（CHOH）.
3.1.14羟基磁珠（粒径500nm，50mg/mL）. 3.1.15PCR反应预混液（2×）（DNA聚合酶1U~2U，荧光PCR缓冲液，MgSO 2.5mmol/L~ 4.0mmol/L，dNTP0.25mmol/L)，也可选用商业的荧光PCR反应预混液.
3.2试剂配制 3.2.1a-淀粉酶溶液（10mg/mL）：称取10mgα-淀粉酶（3.1.1)，溶解于1mL无菌水中.
不可高压灭 菌，分装成数管后于一20℃保存，避免反复冻融.
3.2.2RNA酶A溶液（10mg/mL):称取10 mg无DNA酶的RNA酶A（3.1.9），溶解于1mL无菌水 中，在100℃沸水中湿浴15min~20min，冷却至室温后，分装成数管后于一20C保存，避免反复冻融.
3.2.3氢氧化钠溶液（10mol/L)：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（3.1.7)，溶解后，冷却至室湿， 1
BJS 202410 再加水定容至200mL.
3.2.4Tris-HCI 溶液（1mol/L，pH 8.0)：称取 121.1 g Tris（3.1.4）溶解于 800mL 水中，用 HC1(3.1.6) 调pH至8.0，加水定容至1000mL.
在103.4kPa（121℃）条件下灭菌15min后使用.
3.2.5NaEDTA溶液（0.5 mol/L pH 8.0）：称取18.6gNaEDTA（3.1.5），加人70mL 水中，再加人 适量氢氧化钠溶液（3.2.3），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（3.2.3）调pH至8.0，加水 定容至100mL.
在103.4kPa（121℃）条件下灭菌15min后使用.
3.2.6SDS 缓冲液:称取 1.169 g NaCI(3.1.2)，1 g SDS(3.1.3)，5 mL Tris-HCI 溶液(3.2.4) 1 mL NaEDTA溶液（3.2.5），加水定容至100mL 3.2.7乙酸钾溶液（3mol/L)：称取147g乙酸钾（3.1.10)，用乙酸（3.1.11）将pH调至5.2后，加水定容 至 500 mL.
3.2.8包被液：称取30g聚乙二醇20000（3.1.12)，11.69gNaC1（3.1.2），加水定容至100mL.
3.2.9TE缓冲液（pH 8.0）:在约800mL水中依次加人10mLTris-HCl溶液（3.2.4）和2mL NaEDTA溶液（3.2.5），用HC1(3.1.6）或氢氧化钠溶液（3.2.3）调pH至8.0，加水定容至1000mL，在 103.4kPa（121“C）条件下灭菌15min后使用.
3.2.10乙醇溶液（75%，体积分数）：将无水乙醇（3.1.13）和水按75：25的体积比混合均匀.
3.3检测用引物和探针 引物探针序列见表1. 表1引物探针序列 目标物种 序列（5→3'） 基国来源 F:CCTGAGAAACGGCTACCAT 内参照 R;CGTGTCAGGATTGGGTAAT 18S-RNA P;FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA F;CAAAAGCACGGCACTAGTCA 红薯 R: AGTGAGACAGGGGAAGTGGA g3pdk P FAM-CCCAGCAACCGCTCTTTATA-TAMRA F; ATGCAGAAGTAAGGAAAAAGTAATGTGT 绿豆 R;TCAATAATAGCATGAGGCAAACAAA mgQ062F P;FAM-ACACTATCCTTGCGCTCATACTAGCTCCCC-TAMRA F;GCAACAAGAGGTCTAGTGGATTGA 豌豆 R;CGGACCGACGCCAAGA MEY P;FAM-CTACTCCGAAATGGAAACCACAGAAACCG-TAMRA F;CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCCT 玉米 R-CCACTCCGAGACCCTCAGTC Adh1 P;FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA F;CCTGGTGTCTGGGAATACATC 马铃薯 R;CCGTCGACAAGTTCTTCCTT xF P:FAM-TGTTGAGGAGCTATCTGTCCCTGAGT-TAMRA
BJS 202410 表1引物探针序列（续） 目标物种 序列（5→3’) 基因来源 F;TGGTTCTTGATCTGCGTGAG 木薯 R;TGGGAGAACCTTTCCAACAG 83pdh P;FAM-TGCTGTTGCAACTGCTTAGG-TAMRA 注：F代表上游引物；R代表下游引物；P代表探针.
4仪器和设备 4.1高速粉碎机. 4.2核酸蛋白分析仪， 4.3恒温装置：温度范围25C~95℃. 4.4高速离心机（离心转速>12000r/min）.
4.5微量移液器（0.5 μL~10 μL 2 μL~20 μL 10 μL~100 pμL 20 pμL~200zL 100 μL~1 000 yL).
4.6实时荧光PCR仪.
4.7涡旋混合器.
4.8电子天平：感量分别为0.1g、0.01g、0.001g. 4.9高压灭菌器.
4.10pH计：精度为0.01. 4.11磁力架.
4.12超净工作台.
4.13干燥箱.
5分析步骤 5.1样品预处理 取至少50g样品，高速粉碎机将其粉碎，粉碎后收集到密封袋中，室温保存.
5.2样品DNA的提取 5.2.1样品DNA提取时，设置两个平行.
5.2.2称取约1g预处理后的待测样品于研钵中，加人液氮，充分研磨成粉末后转移至离心管.
5.2.3从5.2.2中称取100mg置于2mL离心管中，加人700μL SDS缓冲液，10μLα-淀粉酶溶液， 30μL蛋白酶K和5μLRNA酶A溶液，在65C水浴锅中加热1h. 5.2.4水浴完成后，冷却至室温，12000r/min离心10min，取500pL上清液加到新的离心管中，再加 人50gL乙酸钾溶液，冰水浴10min.
5.2.5水浴完成后，12000r/min离心10min，取500L上清液加人新的离心管，加人10gL羟基磁珠 （使用前充分混匀），混匀，再加人250pL包被液，混匀5min.
5.2.6用磁力架磁力吸附，待稳定后，移去上清液，用1mL75%乙醇清洗3次，37C干燥箱干燥 10 min 5.2.7干燥完成加入100μLTE缓冲液，混匀，65C水浴10min，磁力吸附取上清液到新的离心管，离
BJS 202410 心管中液体即为提取的样品DNA.
也可用等效的DNA提取方法或商品化的试剂盒提取DNA 5.3DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，As/As值在1.7～2.0之间时，适宜于本方法.
注：实测荧光 PCR扩增试验前，宜将 DNA浓度稀释至10ng/pL~100ng/yL 5.4实时荧光PCR扩增 反应体系总体积为20gL，其中PCR反应预混液（2×)10L，正反向引物（10mol/L）各1L，探 针（10μmol/L)1μL DNA模板（10ng/μL~100ng/μL)2μL 用灭菌去离子水补足至总体积20pL.
真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针，也可用等效的商品化试剂盒进行扩增.
反应参数：94℃1min;95℃20s 60C30s 40个循环.
反应参数随不同实时荧光PCR仪可以略有改变.
5.5试验对照 检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照.
以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，用 已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，用等体积的灭菌去离子水代替模板DNA作为空白对照.
样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系，以C平均值作为最终结果.
6结果判断与表述 6.1质量控制 以下条件有一条不满足时，结果视为无效： a）空白对照：无羧基荧光素（FAM）荧光信号检出： b）阴性对照：无FAM荧光信号检出； c）阳性对照：有FAM荧光信号检出且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0； d）内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0. 6.2结果判定 若Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性. 如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性. 如35.0<Ct值<40.0，则重复试验一次.如再次扩增后Ct值仍为<40.0，则判定被检样品阳性，如 再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性. 6.3结果表述 结果为阳性者，且质量控制正常，则表述为"检出××源性成分”. 结果为阴性者，且质量控制正常，则表述为"未检出××源性成分” 7防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》 中的规定执行. 4
